pdz1-2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建

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1、PDZ1/2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建：高芳，胡书群，孙东，张光毅【摘要】　　目的构建PSD-95结构域PDZ1/2腺病毒重组体。方法以异硫酸氰胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板，采用RT-PCR法获得PDZ1/2的cDNA；与腺病毒穿梭载体用T4DNA连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①经RT-PCR得到了PDZ1/2的cDNA；②酶切鉴定能观察到PDZ1/2和pAdTrack-CMV两条带；③PDZ1/2测序图谱与文献报道完全一致。结论成功构建了含目的基因PDZ1/2的腺病毒穿梭载体重组体。【关键词】PDZ1/2；RT-PCR；

2、腺病毒穿梭载体；序列测定　　Abstract：ObjectiveToconstructrebinantpAdTrack-CMV-PDZ1/2.MethodsThetotalRNAextractedethodbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextractionplate,andthecDNAofPDZ1/2domainplifiedbyRT-PCR;theformerination.Results①ThecDNAofPDZ1/2plifiedbyRT-PCR.②Therebinantcontainedtedigesti

3、on.③ThesequencechromatogramofclonedPDZ1/2ination　　目前，关于缺血性脑卒中神经元损伤和死亡的分子机制主要有3种假说：谷氨酸兴奋毒性、钙超载和自由基。其中，谷氨酸过度激活其受体是缺血性脑卒中脑损伤的关键。　　谷氨酸受体（GluR）有离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体［1］。天门冬氨酸受体（NMDAR）和海人藻酸受体（KAR）是离子型谷氨酸受体的重要成员。GluR6是海人藻酸受体的重要组成部分。基于我们以前的研究和实验结果［2-4］，我们提出一个新的缺血性脑卒中神经元凋亡的信号通路：谷氨酸→GluR6→PSD-95→MLK→MKK7

4、→JNKs→核依赖的/非核依赖的通路→Caspase3。　　此通路中PSD-95蛋白(postsynapticdensity-95)是NMDAR、KAR信号复合体的主要成员。PSD-95家族是膜结合鸟苷酸激酶(membrane-associatedguanylatekinase，MAGUK)家族的亚家族。PSD-95家族的结构特征是：氨基端3个PDZ(PSD-95/Dlg/Z0-1)结构域，1个SH3（Srchomology3）结构域和羧基端无活性的鸟苷酸激酶（GK）结构域。这些结构域可分别介导PSD-95家族蛋白质与特异性蛋白质的相互作用［5-7］。如PDZ1/2结构域介导

5、PSD-95与NMDAR2B和GluR6受体相互作用。　　为了证实过表达PDZ1/2能否抑制NMDAR2B和GluR6与PSD-95的结合，本研究以大鼠海马为原料提取总RNA，通过RT-PCR得到其双链cDNA，经酶切回收后，用T4DNA连接酶将DNA连接到腺病毒穿梭载体上，测序后筛选得到没有发生突变的PDZ1/2腺病毒重组体。　　1材料和方法　　1.1试剂　　酚：氯仿：异戊醇（phenol:chloroform:isoamylalcohol25:24:1）、氨苄青霉素（ampicillin）、矿物油（mineraloil）、低熔点琼脂糖（LMPagarose）为Sigma公

6、司产品。dNTPs、质粒制备试剂盒、T4DNA连接酶、AccessRT-PCRsystem、TotalRNAisolationsystem及限制性内切酶HindⅢ、BglⅡ为Promega公司产品。pAdTrack-CMV为CLONTECH公司产品。1kbDNAladder、琼脂粉、LB培养基为GibcoBRL（GrandIsland，NY，USA）公司产品。琼脂糖为Bio-Rad公司产品。引物由GibcoBRL公司合成。其他常用试剂均为国产分析纯。　　1.2实验动物　　SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，清洁度Ⅱ级，自由饮食，室温12℃12h昼夜节律下饲养。　　1.3菌株

7、　　大肠杆菌菌株JM109由本室保存。　　1.4PDZ1/2cDNA的克隆　　1.4.1大鼠海马的剥离　　取SD大鼠断头处死,开颅后迅速取出海马组织。　　1.4.2总RNA的提取　　将上述海马转移至匀浆器内，加入1ml变性液。然后于冰浴中充分匀浆。匀浆液中加入0.1ml2mol/L醋酸钠（pH4.0）、1ml酚、196μl氯仿、4μl异戊醇，混匀20s后，置冰浴15min，转移至EP管中，于4℃10000g离心20min，转移水相至新EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜沉淀。次日，于4℃10