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1、MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用【关键词】神经生长因子;,PC12细胞;,细胞分化;,信号传导摘要:目的研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt途径在蛇毒神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化中的作用。方法应用蛋白免疫印迹法分析p44/p42MAPK和Akt的磷酸化水平,并利用MAPK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002,观察其对NGF诱导的PC12细胞形态学改变的影响。结果眼镜蛇毒NGF在10ng/mL即可诱导PC12细胞长出突起,100,1000ng/mL作用明显,呈剂量效应关系;NGF
2、能有效刺激p44/p42MAPK、Akt的磷酸化;分别用特异抑制剂PD98059抑制MAPK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF诱导的细胞分化均受抑制。结论蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞的分化作用与p44/p42MAPK和PI3K/Akt途径相关。关键词:神经生长因子;PC12细胞;细胞分化;信号传导ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheroleofmitogenactivatedproteinkinase(MAPK)andphosphoinositide3kinase(PI3K)/Aktpathvenom.MethodsTheph
3、osphorylationofp44/p42MAPKandAktcobravenomcanstimulatep44/p42MAPKandAktphosphorylationandinducethedifferentiationofPC12cellsfrom10ng/mLto1000ng/mL.ThedifferentiationofPC12cellsinducedbyNGFcobravenomrelatestop44/p42MAPKandPI3K/Aktpathega公司),溶于DMSO配制成储存液。抗pERK、pAkt(ser)、βtubulin抗体,辣根过氧化物酶标记的羊
4、抗兔、羊抗小鼠二抗,ECL检测系统(美国Santacruz公司)。多聚赖氨酸(PolyLLysine,美国Sigma公司);DMEM/F12培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);马血清(美国Hyclone公司)。1.2方法1.2.1细胞培养PC12细胞生长于含10％马血清、5％胎牛血清的DMEM/F12培养液(37℃,体积分数为0.05的CO2,饱和湿度),常规传代。实验时培养器皿用多聚赖氨酸溶液包被,增加PC12细胞对培养器皿黏附力。1.2.2p44/p42MAPK、Akt磷酸化检测对数生长期PC12细胞接种于6孔细胞培养板,用无血清培养
5、液饥饿12h,加入不同浓度的PD98059(0.1,1,5,20,50和100μmol/L)或LY294002(1,25,50和100μmol/L)作用30min,再以100ng/mLNGF作用10min。各组处理PC12细胞用冷PBS洗2次,加入细胞裂解液(含1mmol/LNa3VO4)0.15mL,置冰上30min后,收集,离心,上清液即为总的细胞蛋白溶解成分。按常规方法进行蛋白免疫印迹,分离胶为10％,100mA转膜(NC膜),含5％脱脂奶粉封闭液封闭4℃过夜,依次结合一抗和二抗,最后用ECL系统进行检测,X光片显影,以βtubulin为内参照。1.2.3抑制剂对NGF
6、诱导的PC12细胞分化的影响收集常规培养的PC12细胞于含2%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。将细胞以5×104mL-1接种于经多聚赖氨酸包被的24孔培养板中,每孔体积2mL。细胞分组:对照组、NGF组(10,100,1000ng/mL)、NGF（100ng/mL)+PD98059(20μmol/L)、NGF(100ng/mL)+LY294002(50μmol/L),对照组加入等体积的培养液。每组3孔。倒置显微镜下观察细胞分化的形态改变。细胞有1个或以上突起且突起的长度为胞体直径的2倍以上,确定为已分化细胞[4]。作用4d,每组随机选取10个视野(×200),计数,计算分
7、化细胞的百分率。2结果2.1NGF刺激PC12细胞p44/p42MAPK和Akt的磷酸化MAPK、PI3K等信号途径可以被多种细胞生长因子激活,参与介导细胞增殖、抗凋亡及分化等。PC12细胞在无血清的培养液中饥饿12h,然后用100ng/mLNGF刺激10min,APK的磷酸化而活化,对Akt磷酸化也有激活作用。2.2抑制剂对不同信号途径的抑制作用为明确MAPK、PI3K途径在PC12细胞分化中的作用,应用信号途径的特异抑制剂,观察这些抑制剂是否能够选择性阻断其特异的信号途径。结果表明PD98059剂量
