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1、MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用论文.freelL即可诱导PC12细胞长出突起,100,1000ng/mL作用明显,呈剂量效应关系;NGF能有效刺激p44/p42MAPK、Akt的磷酸化;分别用特异抑制剂PD98059抑制MAPK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF诱导的细胞分化均受抑制。结论蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞的分化作用与p44/p42MAPK和PI3K/Akt途径相关。关键词:神经生长因子;PC12细胞;细胞分化;信号传导ABSTRACT:ObjectiveTo
2、investigatetheroleofmitogenactivatedproteinkinase(MAPK)andphosphoinositide3kinase(PI3K)/Aktpathvenom.MethodsThephosphorylationofp44/p42MAPKandAktcobravenomcanstimulatep44/p42MAPKandAktphosphorylationandinducethedifferentiationofPC12cellsfrom10ng/mLto1000ng/mL.Thed
3、ifferentiationofPC12cellsinducedbyNGFcobravenomrelatestop44/p42MAPKandPI3K/Aktpathega公司),溶于DMSO配制成储存液。抗pERK、pAkt(ser)、βtubulin抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗小鼠二抗,ECL检测系统(美国Santacruz公司)。多聚赖氨酸(PolyLLysine,美国Sigma公司);DMEM/F12培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);马血清(美国Hyclone公司)。
4、1.2方法1.2.1细胞培养PC12细胞生长于含10％马血清、5％胎牛血清的DMEM/F12培养液(37℃,体积分数为0.05的CO2,饱和湿度),常规传代。实验时培养器皿用多聚赖氨酸溶液包被,增加PC12细胞对培养器皿黏附力。1.2.2p44/p42MAPK、Akt磷酸化检测对数生长期PC12细胞接种于6孔细胞培养板,用无血清培养液饥饿12h,加入不同浓度的PD98059(0.1,1,5,20,50和100μmol/L)或LY294002(1,25,50和100μmol/L)作用30min,再以100ng/mLNGF作用
5、10min。各组处理PC12细胞用冷PBS洗2次,加入细胞裂解液(含1mmol/LNa3VO4)0.15mL,置冰上30min后,收集,离心,上清液即为总的细胞蛋白溶解成分。按常规方法进行蛋白免疫印迹,分离胶为10％,100mA转膜(NC膜),含5％脱脂奶粉封闭液封闭4℃过夜,依次结合一抗和二抗,最后用ECL系统进行检测,X光片显影,以βtubulin为内参照。1.2.3抑制剂对NGF诱导的PC12细胞分化的影响收集常规培养的PC12细胞于含2%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。将细胞以5×104mL-1接种于经多聚赖氨
6、酸包被的24孔培养板中,每孔体积2mL。细胞分组:对照组、NGF组(10,100,1000ng/mL)、NGF（100ng/mL)+PD98059(20μmol/L)、NGF(100ng/mL)+LY294002(50μmol/L),对照组加入等体积的培养液。每组3孔。倒置显微镜下观察细胞分化的形态改变。细胞有1个或以上突起且突起的长度为胞体直径的2倍以上,确定为已分化细胞4。作用4d,每组随机选取10个视野(×200),计数,计算分化细胞的百分率。1.3统计学处理显著性检验采用t检验。福建医科大学学报2007年1月第41
7、卷第1期何艳等：MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用2结果2.1NGF刺激PC12细胞p44/p42MAPK和Akt的磷酸化MAPK、PI3K等信号途径可以被多种细胞生长因子激活,参与介导细胞增殖、抗凋亡及分化等。PC12细胞在无血清的培养液中饥饿12h,然后用100ng/mLNGF刺激10min,APK的磷酸化而活化,对Akt磷酸化也有激活作用。2.2抑制剂对不同信号途径的抑制作用为明确MAPK、PI3K途径在PC12细胞分化中的作用,应用信号途径的特异抑制剂,观察这些抑制剂是否能够选择性阻
8、断其特异的信号途径。结果表明PD98059剂量依赖性地抑制NGF刺激的p44/p42MAPK磷酸化,而不抑制Akt的磷酸化;LY294002对Akt的磷酸化抑制也呈剂量依赖性,而不抑制p44/p42MAPK的磷酸化(图1)。2.3抑制剂对NGF诱导PC12细胞分化的影响未经NGF处理的PC12细胞呈圆形
