cdmp1诱导大鼠脂肪干细胞体外成软骨细胞的实验

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1、CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞体外成软骨细胞的实验【摘要】目的：应用软骨形态发生蛋白（CDMP1）体外诱导SD大鼠脂肪干细胞向软骨方向分化，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性以及CDMP1诱导的最佳剂量.方法：无菌取8只SD大鼠腹股沟脂肪组织，脂肪干细胞体外培养至第二代，以1×104/孔密度接种于24孔培养板里，12h后加入诱导液（10mL/L新生牛血清DMEM培养液,CDMP1），分ABCD四组（A组：50μg/LCDMP1+基础培养液;B组：100μg/LCDMP1+基础培养液；C组：150μg/LCDMP1+基础培养液；D组：基础培

2、养液），以D组为阴性对照组.诱导14d，倒置显微镜观察细胞形态的变化，MTT法测定CDMP1对其增殖分化能力的影响，行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果：诱导后可见脂肪干细胞形态由长梭型明显向软骨细胞的多角形方向转变.MTT法测定CDMP1对脂肪干细胞的增殖能力提高，其中以C组为最，但ABC三组之间两两比较无统计学意义，故提示CDMP1诱导的最佳浓度约为50μg/L.甲苯胺蓝染色法示糖胺聚糖（GAG）均匀分布于基质中，免疫组化示诱导组Ⅱ型胶原表达阳性，对照组未见阳性表达.结论：CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖（GA

3、G）和Ⅱ型胶原，并使其向软骨方向增殖分化，以50μg/L为CDMP1诱导的最佳浓度，并有望成为软骨组织工程种子细胞的新的方法之一.【关键词】软骨形态，发生蛋白；脂肪干细胞；软骨细胞；胶原Ⅱ型0引言创伤、骨性关节炎(OA)以及关节软骨病都能造成软骨组织损伤，严重影响患者的生活质量.而关节软骨的损伤是不易修复的.由于软骨自发修复能力的局限性,轻度关节软骨损伤会使损伤发展甚至退变.关节软骨的退变是临床的挑战之一，它缺乏令人信服的治疗策略［1］.最近，组织工程作为一种新方法的出现，它是联合种子细胞，支架和生物活性因子，建造功能性的新组织来代替损伤软骨

4、.这就使人们致力于理想的种子细胞，支架材料和生物活性因子的的研究当中.Katayama等［2］用CDMP1基因转染兔骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损，在用CDMP1转染同源BMMC植入兔关节软骨缺损处8a），II型胶原单克隆抗体（博士德），即用型SABC试剂盒（博士德），倒置相差显微镜.7日龄SD仔鼠8只，雌雄不限（购自第四军医大学实验动物中心）.1.2方法1.2.1ADSCs的分离、原代培养和传代无菌条件下切取SD仔鼠腹股沟的脂肪组织，剔去细血管，DHanks液反复吹洗，剪碎脂肪组织，1000r/min离心8min，弃上清，加入1倍体积

5、的10mg/L胶原酶Ⅰ37℃消化60min,用等体积的10mL/L新生牛血清DMEM培养液中和，过200目筛网，900r/min离心8min，弃上清，加10mL/L新生牛血清DMEM培养液，小心吹打约100次，分装接种于25cm2的培养瓶，置37℃50mL/LCO2的培养箱里孵育.24h后首次换液，弃去未贴壁的细胞.以后每2d换液1次，待细胞生长融合至80%时传代，用2.5g/L胰蛋白酶37℃消化约5min,10mL/L新生牛血清DMEM培养液中和，900r/min离心8min.最后以1×104/cm2密度接种于新的25cm2培养瓶中，

6、置37℃50mL/LCO2培养箱中孵育，每隔2d换液1次.1.2.2细胞爬片及成软骨细胞诱导取生长良好的第二代ADSCs细胞以1×103个/孔的密度接种于2块（第一块用来做免疫组化，第二块用来做甲苯胺蓝染色）24孔的培养板里，孔底放置由多聚赖氨酸包被的盖玻片.每板分ABCD四组:对照组（D组）加基础培养液（10mL/L新生牛血清DMEM）培养，诱导组（A，B，C组）于细胞爬片12h后，分别加入相应的诱导液（A组：50μg/LCDMP1+基础培养液；B组：100μg/LCDMP1+基础培养液;C组：150μg/L+基础培养液）.每2d换液一次

7、.37℃CO2箱里培养14d.1.2.3MTT法测定CDMP1对ADSCs增殖的影响取第2代ADSCs细胞，以1×103个/孔密度接种于5块平底96孔培养板里.每板分ABCD四组，对照组(D组)加基础培养液，诱导组（A，B，C组）加相应的诱导培养液（具体同1.2.2）.每隔1d检测1块，分析CDMP1对ADSCs的增殖能力的影响.1.2.4Ⅱ型胶原免疫组织化学的检测细胞爬片第14d，取第一块24孔培养板，取出盖玻片，950mL/L乙醇固定15min，PBS洗2遍，30mL/LH2O2封闭内源性过氧化物酶，5g/LBSA封闭37℃25min，湿

8、盒内加1∶100的一抗（兔抗大鼠II型胶原单克隆抗体），4℃过夜.湿盒内加二抗（兔IgG），37℃30min.PBS漂洗后，二胺基联苯胺（DAB）显色，苏木精轻度复