vegfa及其受体vegfr1与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨

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1、VEGFA及其受体VEGFR1与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨【关键词】血管内皮生长因子血管内皮生长因子受体子宫内膜癌侵袭与转移子宫内膜癌的侵袭与转移明显影响着病人的预后，而肿瘤血管的生成是肿瘤侵袭与转移所必须；研究表明，VEGFA可诱导血管生成［1］。本研究就50例子宫内膜癌患者的癌组织及癌旁正常内膜的VEGFA及其受体VEGFR1的表达进行检测，以探讨它与子宫内膜癌生物学行为的关系，现报道如下。1资料与方法1.1一般资料50例子宫内膜癌及癌旁正常内膜组织标本取自2004年3月至2006年12月间在南京大学医学院附属鼓楼医院的住院患者。年龄42～77岁，平均

2、55岁。手术病理分期:Ⅰa2例，Ⅰb16例，Ⅰc15例，Ⅱa6例，Ⅱb2例，Ⅲa2例，Ⅲc7例。子宫内膜腺癌组织学分级：G111例，G220例，G319例。1．2标本采集子宫离体后立即纵行剖开，取癌组织约2cm×1cm大小,在癌组织基底部2cm外侧取正常内膜约2cm×1cm大小。标本立即放入液氮罐中，-70℃冰箱中保存。1．3采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测mRNA的表达1．3．1总RNA的提取与鉴定每例标本取100mg组织置于玻璃匀浆器中，采用Trizol一步法提取总RNA，样品经分光光度计检测吸光度A值，根据A值计算总RNA浓度，并行热稳定图像分析系统扫描

3、各电泳带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值，即为癌组织和癌旁正常内膜组织的mRNA表达水平。1．3．2引物及试剂设计的引物由上海生物工程公司合成。VEGFA扩增的上游引物为5′GCAGAAGGAGGAGGGCAGAATC3′，下游引物为5′ACACTCCAGGCCCTCGTCATT3′，扩增片段长度为197bp。VEGFR1扩增的上游引物为5′CAAGTGGCCAGAGGCATGGAGTT3′，下游引物为5′GATGTAGTCTTTACCATCCTGTTG3′，扩增片段长度为498bp。以βactin为内参照，

4、上游引物为5′TTCCAGCCTTCCTTCCTGG3′，下游引物为5′TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT3′，扩增片段长度为224bp。Trizol试剂、RNA酶抑制剂、MMIV逆转录酶及TaqDNA聚合酶均购自上海生物工程公司。1．3．3RTPCR逆转录反应体系为30μl，RNA模板量为10μg，采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA，在PTC200PCR扩增仪上扩增。总反应体积为50μl，每管加10mmol·L-1VEGFA或VEGFR1上下游引物各1μl，10mmol·L-1βactin上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，15

5、mol·L-1MgCl24μl，TaqDNA酶0.4μl，加水至50μl。VEGFA反应条件为：94℃变性1min；56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；复性5min。VEGFR1反应条件为：94℃变性1min；62℃退火2min，72℃延伸3min，35个循环；复性5min。1．3．4PCR产物测定取10μlPCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳（120V）30min，在紫外灯下观察扩增的特异条带，凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值。1．4in，取其上清液，各标本取50μl测蛋白浓度（

6、Brandford法），调整各标本蛋白质量浓度为2mg·L-1。取调整浓度后的组织细胞裂解液10μl加入等体积2×电泳加样缓冲液，均匀后置95℃水中加热10min。采用的分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%，在装置（HoeferPharmaciaBiotechInc，USA，型号为miniVEplete，美国）上电泳，积层胶电压为80V，分离胶电压为120V；电泳结束后转膜，转膜装置（BioRad公司，型号miniproteinⅡcell，美国）设电压90V、电流200mA。转膜后的硝酸纤维素膜在封闭液中温和震荡1h，再把膜放入1∶250的稀释一抗中，4℃过液，用T

7、BST液洗膜3次，把膜置于1∶2000稀释的二抗中温和震荡1h，在TBST中洗膜3次，在暗室中膜上加入ECL液4ml，曝光、显影、定影。图像分析系统扫描各X片条带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值,即为癌组织和正常内膜组织的蛋白质表达水平。2结果2．1子宫内膜癌及癌旁正常子宫内膜VEGFA和VEGFR1的表达结果见表1和图1。2.2子宫内膜癌VEGFA和VEGFR1的表达与组织病理学关系结果见表2、3。癌旁及深肌层组VEGFA在mRNA及蛋白质的表达明显高于浅肌层侵袭组（P＜0.05）；G3