新乡地区48例rhd阴性汉人rhd基因多样性研究

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1、新乡地区48例RhD阴性汉人RHD基因多样性研究　　Rh血型是人类红细胞上30个红细胞血型系统中第二个最具有临床意义的血型系统，仅次于ABO血型，位于染色体1p34.3-36.1，主要由RHD和RHCE两个基因组成，分别编码D抗原和C/c、E/e抗原(.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6007)，具有复杂性和多态性。基因缺失、基因交换、错义突变产生D变异体。D变异体主要包括弱D(.de/～fanBiometra公司)、电泳仪(北京六一机器厂)、凝胶成像系统(美国UVP公司)。　　(2)试剂:抗-A、抗-B、IgG单克隆抗-D、抗-E、抗-C、抗-c、抗-e、抗球蛋白试剂均

2、由上海血液生物医药有限责任公司提供;IgG+IgM抗-D(美国Immucor公司)，IgG+IgM抗-D(DIAGAST公司)、血液基因组提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)、人类红细胞RHD阴性鉴定基因检测试剂盒(天津市秀鹏生物技术开发有限公司)、dNTP(北京天根生化科技有限公司)、DNATaq酶(美国Promega公司)、M2000(大连宝生物工程有限公司)。　　1.2血样和血清学检测　　2014年9月-2014年12月间新乡市血液中心在37400份血液中通过血清学试验筛选出RhD阴性供血者48例(RhD阴性率为0.128%)，各抽取EDTA-K2抗凝血2ml，-20℃保

3、存。所有血样再次用微量板进行RhD抗原初筛，同样用3种不同厂家的抗D试剂通过间接抗球蛋白证实为RhD阴性。　　1.3基因组提取及PCR扩增按试剂说明书提取　　基因组DNA，dsDNA浓度范围在30～100ng/μl，A260/A280的OD值在1.7～2.0之间。PCR扩增体系按说明书配制混合液(80μldNTP-Buffer工作液+0.8μlTaq酶+10μlDNA)，再向每个引物孔(1～8孔)各加入10μl上述混合液。PCR扩增程序:96℃预变性2min，96℃变性20s，68℃60s，共5个循环;96℃变性20s后，65℃50s，然后72℃45s，

4、10个循环;96℃变性20s后，62℃50s，然后72℃45s，18个循环;最后72℃延伸5min，4℃保存。然后取10μl扩增产物在2%的琼脂糖凝胶(含EB)电泳，120V电泳18min，全自动凝胶成像仪成相保存结果。RHD阴性鉴定基因检测试剂盒结果分型1。　　1.4统计学分析RH阴性变异型的频率采用直接计数法。　　2结果　　2.1Rh阴性PCR-SSP结果通过PCR-SSP(序列特异性引物聚合酶链反应)对48例RhD阴性无偿献血者进行RHD基因鉴定，所扩基因片段大小依据基因分型结果参照表判断RHD基因型，发现新乡地区存在RHD全缺失型、DELRHD1227A杂合型、RHD-

5、CE(2-9)-D和不确定型。48例RhD阴性无偿献血者RHD基因分型。　　2.2RHD基因频率和ABO、Rh表型分布48例新乡地区RhD阴性无偿献血汉人RHD全缺失型30例(62.5%)，DELRHD1227A杂合型12例(25.0%)，RHD-CE(2-9)-D4例(8.3%)，2例有EXON1、845G、D9特异性扩增，不能判断其变异类型。RHD变异型ABO和Rh抗原表型分型发现A型12例(25.0%)、B型24例(50.0%)、O型12例(25.0%);ccdee29例(60.4%)、Ccdee14例(29.2%)、CCdee3例(6.3%)、ccdEe2例(4.2%)。　　

6、2.3不同种族和地区人群的RHD变异型差异。　　3讨论　　血清学技术检测Rh血型，在预防新生儿溶血病和避免临床输血不良反应中起着很重要作用。临床由于抗D单克隆抗体试剂特异性识别相应抗原表位所限以及胎儿RhD血型判定时标本采集困难，造成D变异型、DEL及RNA拼接位点变异等导致D抗原不表达，如RHD1227A、RHD(IVS3+1g﹥a)、RHD(M2951)等。国内外RHD基因变异型分子结构(基因缺失、基因交换、错义突变)存在着地区和种族差异。本研究发现，新乡地区RHD基因型全缺失型(62.5%)与YeSH等研究的结果一致，由错义突变引起的DELRHD1227A杂合型占25.0%，R

7、HD与RHCE基因交换引起的RHD-CE(2-9)-D占8.3%，与中国北方汉族人群相符，但与YeL等报道的中国南方地区差异性较大，上海地区主要表现为部分D变异体DVI。RHD(1227G>A)频率与国外ScottSA等报道的高加索人有差异，变异型类型与CruzBR等报道的常见的变异型弱D4.2(DAR)及St-LouisM等报道的DELRHD*(93-94insT)相比，本地区与国外RHD变异类型及频率差别较大。且RHD变异型可引起同种免疫反应，D