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1、人RHD基因结构研究及意义论文者：周华友，兰炯采，王晓珠，樊红，孟庆宝，张印则，王从容【关键词】聚合酶链反应【Abstract】AIM:ToanalyzestructureofRHDgene,emphasizingondetectingpromoterofRHDgene,andtoinvestigatemechanismofRHDexpressing.METHODS:60samplesofunrelatedRhD(+)Hans,98samplesofRhD(-)Hansand2samplesofers.RESULTS:Promotersofin
2、dividualsotersoftheRhDnegativeindividualscarryingthepartialorintactRHDgeneechanismofRHDnegative,andtheremayexistanothermechanismofRhDnegativeinindividualsoterregions(geics);polymerasechainreactionsequenceanalysis;DNAprimers;phenotype;genotype【摘要】目的：研究RHD基因结构，重点检测启动子区.freelet
3、raT1型PCR扩增仪和Biometra恒温恒压电泳仪，SYNGENE公司产GeneGenius型凝胶成像系统.1.2方法1.2.1RhD表型检测聚凝胺法检测RhD表型，抗D试剂为美国Immuncor公司和Domining生物公司的单克隆和多克隆抗血清.聚凝胺法RhD阴性样本用改良抗人球蛋白实验确认.改良抗人球蛋白实验RhD阴性样本用三氯甲烷/三氯乙烯做吸收放散试验,以确定是否为Del型(Absorption/elution,Del型).1.2.2基因组DNA的制备使用美国GT公司基因组DNA快速抽提试剂盒,采用盐析法从供血者外周血分离获得:0
4、.3mLEDTA抗凝外周血加1mL红细胞裂解液,离心弃上清,沉淀加入170μL核裂解液及4μLSDS,剧烈振荡,再加入72μL5mol/LNaCl溶液,.freelin,取上清加入210μL异丙醇沉淀DNA,将DNA溶于50～100μLTE溶液中,4℃保存待用.1.2.3RHD基因结构区PCRSSP法检测启动子区检测：12.5μLPCR反应体系组成：50～200ng基因组DNA，1×Buffer(50mmol/LKCl,pH8.0的10mmol/LTrisHCl)，1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTPs，检测引物浓度0.2μ
5、mol/L，以扩增人生长激素基因（HGH）一段434bp产物作为内对照，内对照引物浓度0.08μmol/L，8.335nkatTaqDNA聚合酶.循环参数：95℃预变性5min，然后30个循环：94℃30s,56℃30s,72℃30s,最后72℃延伸5min，4℃保存.电泳：20g/L琼脂糖凝胶（含0.5mg溴化乙锭/L胶），10μLPCR扩增产物点样，5～8V/cm电压电泳30min，凝胶成像.引物序列见Tab1.表1RHD基因启动子区PCRSSP方法所用引物序列（略）2结果10份RHD+/RHD+型标准DNA检出上、下游Rhesus盒，无杂
6、合Rhesus盒，即RHD基因双基因型，10份RHD+/RHD-型标准DNA检出上、下游Rhesus盒和杂合Rhesus盒，即RHD基因单基因型，10份RHD-/RHD-型标准DNA只检出杂合Rhesus盒无上、下游Rhesus盒，即RHD基因全缺失型，以上结果与标准品型别一致(Fig1).98例无血源关系RhD(-)汉族人样本中54例（55.1%）只检出杂合Rhesus盒无上、下游Rhesus盒（RHD-/RHD-型），即RHD基因全缺失型，36例（36.7%）同时检出上、下游和杂合Rhesus盒（RHD+/RHD-型），即RHD基因单基因型
7、，8例（8.2%）只检出上、下游Rhesus盒无杂合Rhesus盒（RHD+/RHD+型），即RHD基因双基因型.在98例RhD阴性样本中检出16例Del型，这16例Del型中10例（62.5%）同时检出上、下游和杂合Rhesus盒（RHD+/RHD-型），6例（37.5%）只检出上、下游Rhesus盒无杂合Rhesus盒（RHD+/RHD+型）.2例弱D型样本均检出RHD基因的10个外显子；98例RhD阴性样本中，54例（55.1%）RHD基因全缺失型样本都没有检出任何RHD基因外显子，36例（36.7%）RHD+/RHD-型，即RHD基因单
8、基因型中24例检出RHD基因10个外显子（非缺失型），12例为外显子部分缺失型；8例（8.2%）RHD+/RHD+型，即RHD基因双基因型中6例均检出
