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1、人RHD基因结构研究及意义者：周华友，兰炯采，王晓珠，樊红，孟庆宝，张印则，王从容【关键词】聚合酶链反应 【Abstract】AIM:ToanalyzestructureofRHDgene,emphasizingondetectingpromoterofRHDgene,andtoinvestigatemechanismofRHDexpressing.METHODS:60samplesofunrelatedRhD(+)Hans,98samplesofRhD(-)Hansand2samplesofers.RESULTS:Promotersofindivi
2、dualsotersoftheRhDnegativeindividualscarryingthepartialorintactRHDgeneechanismofRHDnegative,andtheremayexistanothermechanismofRhDnegativeinindividualsoterregions(geics);polymerasechainreactionsequenceanalysis;DNAprimers;phenotype;genotype 【摘要】目的：研究RHD基因结构，重点检测启动子区，探究RHD基因的表达机制.
3、方法：采用PCRSSP方法，设计3对序列特异性引物，对60例无血源关系RhD(+)汉族人样本、98例无血源关系RhD(-)汉族人样本和2例弱D型汉族人样本RHD基因启动子区约1000bp范围内的4个RHD基因特异性多态性位点进行检测.结果：RhD表型(-)/RHD基因型(-)个体启动子区全缺失，表型RhD阴性基因型为部分缺失或不缺失型个体启动子区都不缺失.结论：RhD表型(-)/RHD基因型(-)个体符合RhD阴性的普遍机制，表型RhD阴性基因型为部分缺失或不缺失型个体存在另一种RhD阴性机制. 【关键词】RHD基因；启动区（遗传学）；聚合酶链反应序
4、列分析；DNA引物；表型；基因型 0引言 人类Rh血型系统（Rh血型系统中基因以RH表示，抗原以Rh表示）是临床最重要的血型系统之一，也是人类29个红细胞血型系统中最复杂最富有多态性的一个系统，该系统抗原抗体不相容能引起溶血性输血反应、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血［1-3］.Rh血型抗原由位于1号染色体短臂1p34.3-1p36.1上两个紧密连锁高度同源的RHD和RHCE基因编码，这两个基因序列同源性高达96%～97%，都含有10个外显子，RHD基因编码RhD多肽，RHCE基因编码RhC/c和RhE/e多肽.在绝大多数高加索人种中，RhD阴性
5、个体RHD基因全缺失，这代表了RhD阴性的普遍机制，对RH基因的深入研究证明RhD阴性多态性存在丰富的种族背景差异，可能有多种RhD阴性机制存在［4-6］.我们采用PCRSSP方法对RhD阴性样本的RHD基因的结构进行了检测，重点检测了启动子区，探讨了汉族人RHD基因的表达机制. 1材料和方法 1.1材料 10份RHD+/RHD+型、10份RHD+/RHD-型和10份RHD-/RHD-型标准DNA样本由美国国立卫生研究院免疫遗传实验室提供.60例无血源关系RhD(+)汉族人样本由广州市血液中心提供；98例无血源关系RhD(-)汉族人样本和2例弱D
6、型汉族人样本由秦皇岛市中心血站、锦州市红十字中心血站、深圳市人民医院输血科和广东省人民医院输血科提供.TaqDNA聚合酶和DNAMarker由大连TAKARA公司提供，德国BiometraT1型PCR扩增仪和Biometra恒温恒压电泳仪，SYNGENE公司产GeneGenius型凝胶成像系统. 1.2方法 1.2.1RhD表型检测聚凝胺法检测RhD表型，抗D试剂为美国Immuncor公司和Domining生物公司的单克隆和多克隆抗血清.聚凝胺法RhD阴性样本用改良抗人球蛋白实验确认.改良抗人球蛋白实验RhD阴性样本用三氯甲烷/三氯乙烯做吸收放散试
7、验,以确定是否为Del型(Absorption/elution,Del型). 1.2.2基因组DNA的制备使用美国GT公司基因组DNA快速抽提试剂盒,采用盐析法从供血者外周血分离获得:0.3mLEDTA抗凝外周血加1mL红细胞裂解液,离心弃上清,沉淀加入170μL核裂解液及4μLSDS,剧烈振荡,再加入72μL5mol/LNaCl溶液,12000g离心5min,取上清加入210μL异丙醇沉淀DNA,将DNA溶于50～100μLTE溶液中,4℃保存待用. 1.2.3RHD基因结构区PCRSSP法检测启动子区检测：12.5μLPCR反应体系组成：50～
8、200ng基因组DNA，1×Buffer(50mmol/LKCl,pH8.0的10mmol/L
