toll样受体2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆与序列分析

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1、Toll样受体2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆与序列分析摘要:目的为研究TLR2胞外域在肽聚糖诱导的信号转导中的功能，构建TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段真核表达载体.方法提取HL-60细胞总RNA，以RT-PCR方法获取了TLR2胞外域cDNA片段，将其与pGEM-TEasy载体连接，转化E.coliJM109，建立了TLR2胞外域的cDNA克隆;籍此，又相继克隆了胞外域的氨基端和羧基端片段，然后将这三个片段克隆到真核表达载体pcDNA3中.结果序列分析表明，与GenBank中的人TLR2全长cDNA序列比较，仅4个碱基不同，同源性为0.998.结论成功获

2、得了HL-60细胞TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆.　　Keyerasechainreaction;cloning，molecular;sequenceanalysis　　Abstract:AIMTofindouttheroleoftheextracellulardo-mainofTLR2inthepeptidoglycan-inducedsignalingpath-ammalianexpressionplasmidsoftheextracellulardo-mainofTLR2anditstentsentencodingpleteextra-cellul

3、ardomaini-nestedRT-PCRmethod　HL-60cells，linkedintopGEM-TEasyvector，transformedintoE.coliJM109，andinsertedintopcDNA3vector.ThententsamplifiedfromitRNAforhumanTLR2inGenBankexcept4nu-cleotides，andologyof0.998.CONCLUSIONTheextracellulardomainofTLR2anditstentsareclonedsuccessfully.　　0引言　　果蝇

4、（Drosophila）Toll和Toll样受体（Toll-likeReceptors，TLRs）是一类跨膜蛋白，由胞外富含亮氨酸的重复序列（Leucine-richrepeats，LRRs）、跨膜区和胞内负责信号转导的结构域构成.TLRs属模式识别受体（PatternRecognitionReceptors，PRRs），可选择性识别具有病原体相关分子模式（PathogenAssociationMolecularPatterns，PAMPs）特殊结构的病原体成分，如脂多糖（LPS）、肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）等，经胞内信号转导途径，激活系列免疫应答

5、基因［1-3］.TLR2胞外域与革兰阳性菌（G+）PGN成分的识别关系较肯定，但具体识别机制尚不清楚［4，5］.为深入研究TLR2的结构与功能，及其与其他TLRs和辅助蛋白相互作用的分子机制，揭示其与感染性疾病的关系，探索新的防治与诊断手段，我们克隆了HL-60细胞系的TLR2胞外域及其氨基端（N端）片段和羧基端（C端）片段，并进行了序列分析、二级结构及理化特性预测.　　1材料和方法　　1.1材料HL-60细胞系由第四军医大学细胞与分子免疫学教研室金伯泉教授提供;RPMI-1640购自美国HyClone公司;新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;TRIzol

6、○R总RNA提取试剂盒购自GibcoBRLLIFETECHNOLOGY公司;TaKaRaRNALAPCRKit（AMV）逆转录PCR试剂盒购自TakaraBiotech有限公司;E.coliJM109菌株、pcDNA3质粒为本室保存;限制性内切酶BamHⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ和LambdaDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarker购自华美生物工程公司;GeneRulerTM50bpDNAladder购自Fermentas公司;QIAEX○RⅡGelExtractionKit购自QIAGEN公司;iniPrepsDNAPurificationSys-tem及pGEM

7、-TEasy载体购自美国Promega公司.　　1.2引物设计与合成以GenBank中人TLR2mRNA序列（ACCESSIONU88878，简称U88878序列）［4］为模板，设计6条引物.其中P1，P2，P3用于半巢式PCR扩增TLR2胞外域完整编码序列，P1和p4用于扩增其胞外域N端片段，而P5和P6用于扩增其胞外域C端片段（Fig1，Tab1）.引物全部由上海Sangon公司合成.　　图1略表1TLR2胞外域及其N端和C端片段PCR引物的设计　略　　1.3细胞培养HL-60细胞在37℃，50mL・L-1CO2条件下，培养于含100mL