toll样受体2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆与序列分析论文

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1、Toll样受体2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆与序列分析论文.freelerasechainreaction;cloning，molecular;sequenceanalysisAbstract:AIMTofindouttheroleoftheextracellulardo-mainofTLR2inthepeptidoglycan-inducedsignalingpath-ammalianexpressionplasmidsoftheextracellulardo-mainofTLR2anditstentsen

2、tencodingpleteextra-cellulardomaini-nestedRT-PCRmethodHL-60cells，linkedintopGEM-TEasyvector，transformedintoE.coliJM109，andinsertedintopcDNA3vector.ThententsamplifiedfromitRNAforhumanTLR2inGenBankexcept4nu-cleotides，andologyof0.998.CONCLUSIONTheextracellulardom

3、ainofTLR2anditstentsareclonedsuccessfully.0引言果蝇（Drosophila）Toll和Toll样受体（Toll-likeReceptors，TLRs）是一类跨膜蛋白，由胞外富含亮氨酸的重复序列（Leucine-richrepeats，LRRs）、跨膜区和胞内负责信号转导的结构域构成.TLRs属模式识别受体（PatternRecognitionReceptors，PRRs），可选择性识别具有病原体相关分子模式（PathogenAssociationMolecularPatte

4、rns，PAMPs）特殊结构的病原体成分，如脂多糖（LPS）、肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）等，经胞内信号转导途径，激活系列免疫应答基因［1-3］.TLR2胞外域与革兰阳性菌（G+）PGN成分的识别关系较肯定，但具体识别机制尚不清楚［4，5］.为深入研究TLR2的结构与功能，及其与其他TLRs和辅助蛋白相互作用的分子机制，揭示其与感染性疾病的关系，探索新的防治与诊断手段，我们克隆了HL-60细胞系的TLR2胞外域及其氨基端（N端）片段和羧基端（C端）片段，并进行了序列分析、二级结构及理化特性预测.1材

5、料和方法1.1材料HL-60细胞系由第四军医大学细胞与分子免疫学教研室金伯泉教授提供;RPMI-1640购自美国HyClone公司;新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;TRIzol○R总RNA提取试剂盒购自GibcoBRLLIFETECHNOLOGY公司;TaKaRaRNALAPCRKit（AMV）逆转录PCR试剂盒购自TakaraBiotech有限公司;E.coliJM109菌株、pcDNA3质粒为本室保存;限制性内切酶BamHⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ和LambdaDNA/HindⅢ+EcoRⅠMark

6、er购自华美生物工程公司;GeneRulerTM50bpDNAladder购自Fermentas公司;QIAEX○RⅡGelExtractionKit购自QIAGEN公司;iniPrepsDNAPurificationSys-tem及pGEM-TEasy载体购自美国Promega公司.1.2引物设计与合成以GenBank中人TLR2mRNA序列（ACCESSIONU88878，简称U88878序列）［4］为模板，设计6条引物.其中P1，P2，P3用于半巢式PCR扩增TLR2胞外域完整编码序列，P1和p4用于扩增其胞

7、外域N端片段，而P5和P6用于扩增其胞外域C端片段（Fig1，Tab1）.引物全部由上海Sangon公司合成.图1略表1TLR2胞外域及其N端和C端片段PCR引物的设计略1.3细胞培养HL-60细胞在37℃，50mLL-1CO2条件下，培养于含100mLL-1小牛血清的RP-MI-1640完全培养基.1.4总RNA提取取约5×106新鲜HL-60细胞，用TRIzol○R试剂盒提取总RNA.总RNA沉淀溶于100μLDEPC处理水中，-80℃保存.1.5RT┐PCR1.5.1RT模板总RNA5μL，OligodT为引

8、物，83.35nkatAMV逆转录酶作用下合成cDNA.20μL逆转录反应体系，42℃反应60min，99℃灭活5min.1.5.2PCR1取5μL逆转录产物为模板，以P1，P2为引物，扩增TLR2胞外域加跨膜段cDNA片段.反应参数为:95℃预变性10min，94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸120s，共32个循环，最后72℃延伸10min.1