mox40ig的表达及其生物学活性的初步研究

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1、mOX40Ig的表达及其生物学活性的初步研究:刘艳菲,林志娟,冯永堂,许传武,史琳,苗乃法【摘要】  目的:构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白。方法:RTPCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2EGFPmOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体。脂质体法

2、转染CHO细胞获得稳定表达,用RTPCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDSPAGE进行鉴定。3HTdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用。结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40Ig基因序列正确,RTPCR与ELISA证实mOX40Ig的表达,SDSPAGE证实其为mOX40Ig融合蛋白,3HTdR掺入法显示mOX40Ig在体外能有效地促进B细胞增殖。结论:成功地构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白的稳定

3、表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础。【关键词】OX40mOX40IgCHO细胞真核表达  [Abstract]AIM:ToconstructarebinanteukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IgfusiongeneandobtainmOX40IgfusionproteinentencodingthehumanIgG1FcplifiedbyRTPCRandtheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1hIg

4、G1FcOX40extracellulargenepIRES2EGFPOX40byPCRandtheninsertedintotherebinantvectorpcDNA3.1hIgG1Fc.Therightrebinantnchromatography,themOX40Igfusionproteinethod.RESULTS:ThehIgG1Fc,mOX40extracellulargeneandmOX40IggeneOX40IgfusionproteininCHOcellsedbyRTPCR,sandOX40I

5、gfusionproteinstimulatedtheproliferationofBcellsinvitro.CONCLUSION:AeukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IghasbeenconstructedsuccessfullyandthestableexpressionofmOX40IgfusionproteinOX40Ig;CHOcellline;eukaryoticexpression  OX40/OX40L作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子

6、,对延长T细胞的寿命、促进其增殖[1,2]、刺激DC细胞的分化成熟[3]、促进生发中心的形成均有重要的作用[4]。本研究我们通过构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,将其转染CHO细胞,获得可溶性mOX40Ig融合蛋白的稳定表达,并进行初步的鉴定和生物学活性检测,为进一步研究OX40分子在肿瘤免疫、自身免疫性疾病中的作用奠定基础。  1材料和方法  1.1材料TRIzol购自Gibco公司;MMLV第1链cDNA合成试剂盒、TaqDNA聚合酶、各种限制性内切酶及T4连接酶均购自MBI公司;Agarose(西班牙分装

7、)购自上海生工公司;LipofectinReagent购自Invitrogen公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。G418购自北京华美公司。蛋白A亲和层析柱购自本元正阳公司。羊抗人IgG、正常人IgG、HRP标记鼠抗人IgGFc购自宁波新芝生物公司。小鼠mIgM激发型抗体及抗CD40激发型单克隆抗体(mAb)购自RD公司。3HTdR购于中国原子能科学研究院。  1.2方法  1.2.1引物的设计与合成根据GenBank中登录的人IgG1Fc段及小鼠OX40胞外段cDNA序列,利用引物设计软件PrimerPremier5.0进行引物

8、设计,全部引物由上海生工合成。hIgG1Fc段上、下游引物P1、P2为:5′CGGAATTCACTTGCCCACCGTGCCCAG3′,含EcoRI的酶切位点,5′CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG3′,含Xh

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1、mOX40Ig的表达及其生物学活性的初步研究:刘艳菲,林志娟,冯永堂,许传武,史琳,苗乃法【摘要】  目的:构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白。方法:RTPCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2EGFPmOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体。脂质体法

2、转染CHO细胞获得稳定表达,用RTPCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDSPAGE进行鉴定。3HTdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用。结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40Ig基因序列正确,RTPCR与ELISA证实mOX40Ig的表达,SDSPAGE证实其为mOX40Ig融合蛋白,3HTdR掺入法显示mOX40Ig在体外能有效地促进B细胞增殖。结论:成功地构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白的稳定

3、表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础。【关键词】OX40mOX40IgCHO细胞真核表达  [Abstract]AIM:ToconstructarebinanteukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IgfusiongeneandobtainmOX40IgfusionproteinentencodingthehumanIgG1FcplifiedbyRTPCRandtheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1hIg

4、G1FcOX40extracellulargenepIRES2EGFPOX40byPCRandtheninsertedintotherebinantvectorpcDNA3.1hIgG1Fc.Therightrebinantnchromatography,themOX40Igfusionproteinethod.RESULTS:ThehIgG1Fc,mOX40extracellulargeneandmOX40IggeneOX40IgfusionproteininCHOcellsedbyRTPCR,sandOX40I

5、gfusionproteinstimulatedtheproliferationofBcellsinvitro.CONCLUSION:AeukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IghasbeenconstructedsuccessfullyandthestableexpressionofmOX40IgfusionproteinOX40Ig;CHOcellline;eukaryoticexpression  OX40/OX40L作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子

6、,对延长T细胞的寿命、促进其增殖[1,2]、刺激DC细胞的分化成熟[3]、促进生发中心的形成均有重要的作用[4]。本研究我们通过构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,将其转染CHO细胞,获得可溶性mOX40Ig融合蛋白的稳定表达,并进行初步的鉴定和生物学活性检测,为进一步研究OX40分子在肿瘤免疫、自身免疫性疾病中的作用奠定基础。  1材料和方法  1.1材料TRIzol购自Gibco公司;MMLV第1链cDNA合成试剂盒、TaqDNA聚合酶、各种限制性内切酶及T4连接酶均购自MBI公司;Agarose(西班牙分装

7、)购自上海生工公司;LipofectinReagent购自Invitrogen公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。G418购自北京华美公司。蛋白A亲和层析柱购自本元正阳公司。羊抗人IgG、正常人IgG、HRP标记鼠抗人IgGFc购自宁波新芝生物公司。小鼠mIgM激发型抗体及抗CD40激发型单克隆抗体(mAb)购自RD公司。3HTdR购于中国原子能科学研究院。  1.2方法  1.2.1引物的设计与合成根据GenBank中登录的人IgG1Fc段及小鼠OX40胞外段cDNA序列,利用引物设计软件PrimerPremier5.0进行引物

8、设计,全部引物由上海生工合成。hIgG1Fc段上、下游引物P1、P2为:5′CGGAATTCACTTGCCCACCGTGCCCAG3′,含EcoRI的酶切位点,5′CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG3′,含Xh

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