mox40ig的表达及其生物学活性的初步研究

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1、mOX40Ig的表达及其生物学活性的初步研究作者:刘艳菲,林志娟,冯永堂,许传武,史琳,苗乃法【摘要】  目的:构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白。方法:RTPCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2EGFPmOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载

2、体。脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RTPCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDSPAGE进行鉴定。3HTdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用。结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40Ig基因序列正确,RTPCR与ELISA证实mOX40Ig的表达,SDSPAGE证实其为mOX40Ig融合蛋白,3HTdR掺入法显示mOX40Ig在体外能有效地促进B细胞增殖。结论:成功地构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40

3、Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础。【关键词】OX40mOX40IgCHO细胞真核表达15  [Abstract]AIM:ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IgfusiongeneandobtainmOX40IgfusionproteinwithbioactivitybytransfectingCHOcells.METHODS:Thegenefragmentenco

4、dingthehumanIgG1FcwasamplifiedbyRTPCRandtheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1hIgG1Fcwasconstructed.Aftersequencing,mOX40extracellulargenewasclonedfrompIRES2EGFPOX40byPCRandtheninsertedintotherecombinantvectorpcDNA3.1hIgG1Fc.Therightrecombinantwastransfectedin

5、toCHOcellswithlipofectinRagentanditsexpressionwasdetectedbyRTPCRandsandwichELISA.AfterpurifiedbyproteinAaffinitycolumnchromatography,themOX40IgfusionproteinwasidentifiedbySDSPAGEanditseffectontheproliferationofBcellsinvitrowasstudiedby3HTdRmethod.RESULTS:Theh

6、IgG1Fc,mOX40extracellulargeneandmOX40IggenewereconsistentwithDNAsequencing.TheexpressionofmOX40IgfusionproteininCHOcellswasconfirmedbyRTPCR,sandwichELISAandSDSPAGE.3HTdRanalysisshowedthemOX40IgfusionproteinstimulatedtheproliferationofBcellsinvitro.CONCLUSIO

7、N:AeukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IghasbeenconstructedsuccessfullyandthestableexpressionofmOX40Igfusionproteinwithbioactivityhasbeen15acquired,whichlaysasolidbasisforfurtherstudyoftheapplicationrelatedtoOX40.  [Keywords]OX40;mOX40Ig;CHOcellli

8、ne;eukaryoticexpression  OX40/OX40L作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子,对延长T细胞的寿命、促进其增殖[1,2]、刺激DC细胞的分化成熟[3]、促进生发中心的形成均有重要的作用[4]。本研究我们通过构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,将其转染CHO

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1、mOX40Ig的表达及其生物学活性的初步研究作者:刘艳菲,林志娟,冯永堂,许传武,史琳,苗乃法【摘要】  目的:构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白。方法:RTPCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2EGFPmOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载

2、体。脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RTPCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDSPAGE进行鉴定。3HTdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用。结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40Ig基因序列正确,RTPCR与ELISA证实mOX40Ig的表达,SDSPAGE证实其为mOX40Ig融合蛋白,3HTdR掺入法显示mOX40Ig在体外能有效地促进B细胞增殖。结论:成功地构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40

3、Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础。【关键词】OX40mOX40IgCHO细胞真核表达15  [Abstract]AIM:ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IgfusiongeneandobtainmOX40IgfusionproteinwithbioactivitybytransfectingCHOcells.METHODS:Thegenefragmentenco

4、dingthehumanIgG1FcwasamplifiedbyRTPCRandtheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1hIgG1Fcwasconstructed.Aftersequencing,mOX40extracellulargenewasclonedfrompIRES2EGFPOX40byPCRandtheninsertedintotherecombinantvectorpcDNA3.1hIgG1Fc.Therightrecombinantwastransfectedin

5、toCHOcellswithlipofectinRagentanditsexpressionwasdetectedbyRTPCRandsandwichELISA.AfterpurifiedbyproteinAaffinitycolumnchromatography,themOX40IgfusionproteinwasidentifiedbySDSPAGEanditseffectontheproliferationofBcellsinvitrowasstudiedby3HTdRmethod.RESULTS:Theh

6、IgG1Fc,mOX40extracellulargeneandmOX40IggenewereconsistentwithDNAsequencing.TheexpressionofmOX40IgfusionproteininCHOcellswasconfirmedbyRTPCR,sandwichELISAandSDSPAGE.3HTdRanalysisshowedthemOX40IgfusionproteinstimulatedtheproliferationofBcellsinvitro.CONCLUSIO

7、N:AeukaryoticexpressionvectorcontainingpcDNA3.1mOX40IghasbeenconstructedsuccessfullyandthestableexpressionofmOX40Igfusionproteinwithbioactivityhasbeen15acquired,whichlaysasolidbasisforfurtherstudyoftheapplicationrelatedtoOX40.  [Keywords]OX40;mOX40Ig;CHOcellli

8、ne;eukaryoticexpression  OX40/OX40L作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子,对延长T细胞的寿命、促进其增殖[1,2]、刺激DC细胞的分化成熟[3]、促进生发中心的形成均有重要的作用[4]。本研究我们通过构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体,将其转染CHO

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