l型电压门控钙通道α1c亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达

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1、L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达【摘要】目的构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-typevoltage-gatedcalciumchannels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转

2、染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达。结果扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带。结论成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达。【关键词】L-型电压门控钙通道α1C亚基克隆表达Abstract:ObjectiveToconstructande

3、xpressinCOS-7cellstheenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)taggedcarboxylterminalsequence(CT,1587-2169)ofL-typevoltage-gatedcalciumchannelα1Csubunits.MethodsTheCTcDNAplifiedbyRT-PCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1.EGFPcDNAplifiedbyPCRandclonedintopcDNA3.1-CTrebinant.EGFPinuso

4、fthefull-lengthCT.Therebinantethodoflipofectionandtheproteinexpressionicroscopyandimmunoblotanalysis.ResultsCTcDNAandEGFPcDNAmunoblotanalysisdisplayedadistinctbandinthepcDNA3.1-CT-EGFPtransfectedgroup.ConclusionpcDNA3.1-CT-EGFPrebinantissuccessfullyconstructedandcanbeexpressedinCOS-7cells.

5、Keychannels;α1Csubunits;clone;expression神经元胞内Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素,电压门控钙通道(voltage-gatedcalciumchannels,VGCCs)是介导Ca2+内流的主要方式之一[1]。L型电压门控钙通道(L-VGCCs)广泛分布于哺乳动物中枢神经系统[2-3],当神经元细胞膜除极时开放,胞外的钙离子流入胞内,参与胞内钙稳态和神经兴奋性的调控,与突触可塑性[4]、基因表达[5-6]、激素分泌[7]等多种神经元生理过程有关。中枢神经系统L-VGCCs是由α1、β、α2、δ亚基组成的糖基化多肽复合体,α2亚基位

6、于胞外,α1和δ亚基为跨膜亚基,β亚基位于胞内。其中α1亚基是形成离子通道的主要功能亚基,其他亚基主要起调节作用。神经型L-VGCCs的α1亚基主要是α1C和α1D亚型[8]。α1C(Cav1.2)亚基主要分布在海马、纹状体、大脑皮质等对缺血敏感脑区的神经元胞体和近端的树突[8],其位于胞内的C端包含多个功能基序和结构域,有EF手基序(EFhandmotif)、1-8-14基序(1-8-14motif)、LA基序(LAmotif)、CB基序(calmodulin-bindingmotif,CBmotif)、C端结合区、富含脯氨酸结构域(proline-richdomain,

7、PRD)和C端抑制性结构域等,上述基序和结构域通过与其他信号分子相互作用而调控通道的功能[1]。本研究构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记的α1C亚基羧基末端肽段(含1587-2169位氨基酸残基,简称CT)的真核表达载体pcDNA3.1-CT-EGFP,为进一步研究α1C亚基在缺血性脑损伤中的作用及机制奠定基础。1材料和方法1.1载体、菌株和细胞株质粒pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司,pGEM-T载体购自Promega公司;大肠杆

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1、L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达【摘要】目的构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-typevoltage-gatedcalciumchannels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转

2、染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达。结果扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带。结论成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达。【关键词】L-型电压门控钙通道α1C亚基克隆表达Abstract:ObjectiveToconstructande

3、xpressinCOS-7cellstheenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)taggedcarboxylterminalsequence(CT,1587-2169)ofL-typevoltage-gatedcalciumchannelα1Csubunits.MethodsTheCTcDNAplifiedbyRT-PCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1.EGFPcDNAplifiedbyPCRandclonedintopcDNA3.1-CTrebinant.EGFPinuso

4、fthefull-lengthCT.Therebinantethodoflipofectionandtheproteinexpressionicroscopyandimmunoblotanalysis.ResultsCTcDNAandEGFPcDNAmunoblotanalysisdisplayedadistinctbandinthepcDNA3.1-CT-EGFPtransfectedgroup.ConclusionpcDNA3.1-CT-EGFPrebinantissuccessfullyconstructedandcanbeexpressedinCOS-7cells.

5、Keychannels;α1Csubunits;clone;expression神经元胞内Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素,电压门控钙通道(voltage-gatedcalciumchannels,VGCCs)是介导Ca2+内流的主要方式之一[1]。L型电压门控钙通道(L-VGCCs)广泛分布于哺乳动物中枢神经系统[2-3],当神经元细胞膜除极时开放,胞外的钙离子流入胞内,参与胞内钙稳态和神经兴奋性的调控,与突触可塑性[4]、基因表达[5-6]、激素分泌[7]等多种神经元生理过程有关。中枢神经系统L-VGCCs是由α1、β、α2、δ亚基组成的糖基化多肽复合体,α2亚基位

6、于胞外,α1和δ亚基为跨膜亚基,β亚基位于胞内。其中α1亚基是形成离子通道的主要功能亚基,其他亚基主要起调节作用。神经型L-VGCCs的α1亚基主要是α1C和α1D亚型[8]。α1C(Cav1.2)亚基主要分布在海马、纹状体、大脑皮质等对缺血敏感脑区的神经元胞体和近端的树突[8],其位于胞内的C端包含多个功能基序和结构域,有EF手基序(EFhandmotif)、1-8-14基序(1-8-14motif)、LA基序(LAmotif)、CB基序(calmodulin-bindingmotif,CBmotif)、C端结合区、富含脯氨酸结构域(proline-richdomain,

7、PRD)和C端抑制性结构域等,上述基序和结构域通过与其他信号分子相互作用而调控通道的功能[1]。本研究构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记的α1C亚基羧基末端肽段(含1587-2169位氨基酸残基,简称CT)的真核表达载体pcDNA3.1-CT-EGFP,为进一步研究α1C亚基在缺血性脑损伤中的作用及机制奠定基础。1材料和方法1.1载体、菌株和细胞株质粒pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司,pGEM-T载体购自Promega公司;大肠杆

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