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1、探讨缺氧后处理的心肌保护机制 尽管各种治疗手段的改进,缺血性心脏病仍是目前全球致死性疾病的首要病因。缺血预处理(IPC)被公认为有效的心肌保护方式,但IPC必须在缺血前应用,因此临床应用受到限制。研究人员发现缺血后处理可以通过减小缺血心肌梗死面积,提高血管内皮细胞功能等途径发挥心肌保护功能。 而且缺血后处理不受时间的限制,已有研究人员证实缺血后处理可以在经皮冠状动脉介入术中使用。然而缺血后处理的分子机制仍然不清楚。 目前多数研究使用乳鼠心肌细胞或者新生鼠心肌细胞缺氧复氧模型。新生鼠心肌细胞与成年鼠心肌细胞在形态、结构和功能上存在很大差异,很难将新生期心肌细胞培养所得的研
2、究结论应用到完全分化的成熟心肌细胞中。且成年心肌细胞更有科学研究价值。故本实验采用成年大鼠心肌细胞缺氧复氧模型探讨缺氧后处理的心肌保护机制。 1材料与方法 1.1动物SD大鼠,雄性,体质量250~350g,由重庆第三军医大学实验动物中心提供[SCXK(渝)2012-0005]。 1.2主要药品、试剂及仪器硫氢化钠(Sigma,美国);M199培养基(Thermo,美国);层粘连蛋白(Sigma,美国);Ⅱ型胶原酶(Sigma,美国);磷酸化p38MAPK一抗、b-actin以及相应的二抗(SantaCruz,美国);线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(碧云天生物技术研究
3、所,江苏);ALC-HP型离体心脏灌流实验装置(奥尔科特生物科技有限公司,中国);DIG-303A型艾柯超纯水器(成都唐氏康宁科技发展有限公司,中国);激光共聚焦显微镜(Leica,德国);95%O2+5%CO2细胞培养箱(Thermo,美国);95%N2+5%CO2细胞培养箱(Thermo,美国);Petri皿(杭州生友生物技术有限公司,中国);其他试剂均为国产分析纯。 1.3心肌细胞的分离培养腹腔注射异戊巴比妥40mg/kg,肝素250μg/kg麻醉后迅速剑突下剖胸取出心脏,应用langendorff离体灌注装置,依次逆行灌注750μmCa2+液,无Ca2+
4、EGTA液,Ⅱ型胶原酶液;之后将消化好的心脏浸泡于5mL含1%的Ⅱ型胶原酶液中,并置于37℃恒温水浴摇床上震荡5min/次,160μm无菌滤X过滤收集酶液于无菌试管内,置于37℃恒温水槽内等待心肌细胞自然沉降,重复操作5次;酶洗脱洗涤沉降细胞3~4次,M199培养基洗涤细胞2次,收集细胞;将细胞数以104/cm2的密度平铺于层粘连蛋白预处理的Petri皿中,加入培养基放入95%O2+5%CO2细胞培养箱。 1.4实验分组将每次分离培养的细胞随机分为3组:正常组(NOR)、缺氧复氧组(H/R)、缺氧后处理组(HP)。NOR组细胞持续在95%O2+5%CO2细胞培养箱中培
5、养6h;H/R组正常培养4h后换上缺氧培养基(临用前99.9%高纯氮气饱和1h,并测血气氧分压<60mmHg)置于缺氧培养箱中1h后,再次正常培养1h;HP组于再次正常培养前进行复氧3min/缺氧3min,重复3次;余操作与H/R组相同。 1.5检测指标 1.5.1心肌细胞线粒体膜电位检测分组处理结束后,吸除培养基,加入1mL的细胞培养液及1mLJC-1染色工作液,孵育20min,激光共聚焦显微镜下观察。检测JC-1单体时激发光为490nm,发射光为530nm,产生绿色荧光;检测JC-1聚合物时,把激发光设置为525nm,发射光为590nm,产生红色荧光。红绿荧
6、光的比值为线粒体膜电位的高低。 由不知分组情况的实验人员随机选择8个不同视野观察30个细胞。 1.5.2APK)表达量各组加入去污裂解液裂解细胞,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取50g总蛋白,加等量缓冲液,将电泳分离后的蛋白电转至PDVF膜上,经封闭、洗脱后加入磷酸化p-p38MAPK一抗,孵育过夜,加入相应的荧光二抗,避光孵育1h,扫描PDVF膜。分析软件检测各组p-p38MAPK条带积分光密度值与β-actin条带积分光密度值,两者的比值反映蛋白表达水平。 1.5.3心肌细胞内钙离子浓度各组培养基加入2mLFlou-3AM(5μL/mol)负载3
7、0min。吸除培养基,用磷酸盐缓冲液洗涤3遍后,吸除液体,上镜检测。由不知分组情况的实验人员随机选择8个不同视野观察30个细胞内钙离子荧光强度。 1.6统计学方法采用SPSS17.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数标准差(x珚±s)表示。各组间采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1缺氧后处理对心肌细胞线粒体膜电位(MMP)的影响与正常组比较,H/R组和HP组MMP显着降低(P<0.05);HP组MMP明显高于H/R组(P>0.05)
