探讨p.g及致病岛rag基因在正畸牙龈炎性反应中的作用

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1、探讨P.g及致病岛rag基因在正畸牙龈炎性反应中的作用　　正畸治疗中牙龈炎性反应是固定矫治过程中的常见并发症，牙龈炎症的发生与诸多因素有关，牙周致病菌是重要因素之一。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)是目前公认的慢性牙周炎的主要致病菌之一，能分泌大量的毒力因子，导致牙周组织破坏，在牙周病的发生、发展中起重要作用。致病岛的发现使人们对细菌致病性有更深的认识。目前rag位点被确定为P.g的致病岛基因之一，研究证实，rag位点失活会使P.g的致病性降低，对牙周组织的破坏减少。rag位点在临床菌株中有4种基因型，分别命名为rag-1、rag-2

2、、rag-3和rag-4，不同基因型的致病能力亦不同。本研究采用16SrDNAPCＲ和多重PCＲ对P.g及致病岛rag基因进行检测，分析其与临床指标的关系，探讨P.g及致病岛rag基因在正畸牙龈炎性反应中的作用。　　　　资料和方法　　　　1.材料　　　　牙龈卟啉单胞菌P.g(ATCC33277)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，F.n)(ATCC25586)和伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemitans，A.a)(ATCC29522)(购自四川大学华西口腔医学院);牙龈卟啉单胞菌()，用无菌双蒸水补充至总体积2

3、5μL。　　　　多重PCＲ反应体系:10倍反应缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，dNTPs0.5μL，模板DNA5.0μL，引物2.0μL(将未经稀释的5对引物的原始液混合稀释后的引物作为应用液，计作引物A，将4种rag基因型的引物混合稀释后的引物计作引物B)，用无菌双蒸水补充至总体积25μL。　　　　PCＲ循环条件:94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min(30个循环);72℃延伸10min。16SrDNAPCＲ与多重PCＲ对标准株的检测:以16SrDNA引物扩增P.g2个标准菌株

4、(ATCC33277和es;TAE电泳缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5mg/L溴化乙锭)，电泳条件为电压90V，时间15～20min，凝胶成像分析。　　　　4.统计学分析　　　　采用SPSS13.0统计软件，组间P.g及致病岛rag基因检出率的差异用χ2检验;P.g及致病岛rag基因检出率与患者年龄及临床指数的差异用独立样本的t检验;细菌检出率与各级临床指标之间的关系用Spearman等级相关分析。　　　　结果1.16SrDNAPCＲ与多重PCＲ对标准株的检测结果琼脂糖凝胶电泳结果可见，应用16SrDNAPCＲ技术，P.gATCC33277和P.gn;1.0

5、87mm，对照组(20例)为1.882±0.235mm，牙周炎组(25例)为5.688±0.459mm。牙周炎组高于正畸牙龈炎组，两者均显著高于对照组(P＜0.05)。　　　　3.16SrDNAPCＲ及多重PCＲ对临床标本检测结果以16SrDNA引物PCＲ扩增102例受试者临床标本，检出P.g情况见表2;正畸牙龈炎组明显高于对照组，牙周炎组高于正畸牙龈炎组和对照组，三者之间有显著性差异(χ2=15.918，P＜0.001)。PCＲ对正畸牙龈炎患者临床标本P.g检测结果见图3，a为标准P.g菌株阳性对照;b为空白对照;c～n为临床标本，其中

6、除c、h外，均扩增出404bp目的条带。　　　　以pn为引物PCＲ扩增65例P.g阳性患者临床标本，扩增出致病岛rag基因的有52例，结果见表2。正畸牙龈炎组明显高于对照组，牙周炎组高于正畸牙龈炎组和对照组，三者之间有显著性差异(χ2=30.630，P＜0.001)。多重PCＲ对正畸牙龈炎患者临床标本中致病岛rag基因的检测结果见图4，临床标本a、b均扩增出628bp目的条带，c扩增出979bp目的条带，d扩增出628bp和739bp目的条带，f扩增出739bp目的条带，e扩增出423bp目的条带，g未见目的条带。　　　　4.P.g及致病岛rag基因检出率与GI之间

7、的关系用Spearman等级相关分析P.g及致病岛rag基因检出率均与牙龈指数GI之间存在明显的正相关关系(P＜0.01)。65例PCＲ扩增阳性的患者平均年龄为25.54岁，而阴性的患者年龄平均为16.19岁，二者具有明显差异(t=3.922，P＜0.001)(表3)。　　　　讨论　　　　固定矫治是矫治错颌畸形的主要方法，但由于矫治装置的加入，使口腔微生态环境发生很大的变化，原有的微生态平衡状态被破坏，从而对口内定居的微生物产生影响，导致牙龈组织的炎症。P.g是革兰阴性专性厌氧菌，具有一系列逃避宿主防御机制及破坏宿