探讨smad7对acta-smads通路的调控机制

《探讨smad7对acta-smads通路的调控机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、探讨Smad7对ActA/Smads通路的调控机制　　激活素Ａ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ，Ａｃｔ　Ａ）是转化生长因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β，ＴＧＦ－β）超家族成员之一，其作为ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ信号通路的第一信使，通过触发下游细胞内Ｓｍａｄｓ级联反应，完成具有一定生物学功能的信号转导过程。前期研究发现ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路具有抗缺血损伤的神经保护作用。但其相关信号转导及调节机制尚需进一步研究，本研究以该通路中重要的细胞内调节因子Ｓｍａｄ７

2、为靶点，利用ＲＮＡ干扰技术抑制Ｓｍａｄ７基因表达，检测其对ＰＣ１２细胞ＯＧＤ损伤及ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化水平的影响，探讨Ｓｍａｄ７对ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的调控机制。　　１材料和方法　　１．１主要材料　　大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤ＰＣ１２细胞系购自中国医学科学院肿瘤细胞库。兔抗大鼠ＡｃｔＡ、Ｓｍａｄ７、β－ａｃｔｉｎ抗体购自Ｓａｎｔａ公司，羊抗兔二抗购自鼎国公司，鼠神经生长因子（ＮＧＦ）购自Ｓｉｇｍａ公司，Ｔｒ－ｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒购自上海生工公司，Ｑｕａｎｔ－ｓｃｒｉｐｔ　ｃＤＮ

3、Ａ合成试剂盒、Ｒｅａｌ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）试剂盒购自天根公司。Ｓｍａｄ７和内参ＧＡＰ－ＤＨ基因引物委托上海生工合成。　　１．２实验方法　　１．２．１　ＰＣ１２细胞培养及神经元转化含１０％马血清及１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养基常规培养ＰＣ１２细胞，２－３天换液后，当细胞接近８０％融合时，胰酶消化传代。细胞贴壁后加入终浓度为５０ｎｇ／ｍｌ的ＮＧＦ，连续刺激７天以诱导细胞神经元样转化。　　１．２．２氧糖剥夺模型的建立神经元样ＰＣ１２细胞经含有１０％胎牛血清和１．０ｍｏｌ／Ｌ　Ｎ

4、ａ２Ｓ２Ｏ４的无糖ＤＭＥＭ培养液培养１６ｈ，建立ＯＧＤ１６ｈ组。　　１．２．３大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ合成设计大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，正义链５－ａａｃｇａｕｃｕｇｃｇｃｕｃｇｕｃｃｇｇｃｇｕｄｔｄｔ－３；反义链３－ｄｔｄｔｕｕｇｃ－ｕａｇａｃｇｃｇａｇｃａｇｇｃｃｇｃａ－５。ＳｉＲＮＡ及阴性对照基因序列委托吉凯生物有限公司合成。　　１．２．４　ｓｉＲＮＡ转染及分组２４孔板内细胞８０％融合时行转染，于前一天将培养液更换为不含血清及抗生素的高糖ＤＭＥＭ，分别转染靶向Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮ

5、Ａ，阴性ｓｉＲＮＡ及对照ＰＢＳ，建立阳性转染组，阴性转染组及空转染组，转染浓度５０ｎＭ，２４ｈ后行ＯＧＤ１６ｈ。　　１．２．５　Ｓｍａｄ７基因ｍＲＮＡ的表达检测收集细胞，Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ。应用ＡＢＩ７５００Ｆａｓｔ型实时荧光定量ＰＣＲ仪对Ｓｍａｄ７基因及内参ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ的表达进行检测。引物序列如下：Ｓｍａｄ７上游５＇－ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－ＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣ－３＇，下游５＇－ＡＧＴ　ＡＡＧＧＡＧ－ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＣ－３＇，片段大小：１０４ｂｐ；ＧＡＰＤＨ上游

6、５＇－ＧＧＴ　ＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴ－３＇，下游５＇－ＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣ－３＇，片段大小：１７１ｂｐ。结果应用Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｄｄＣｔ）Ｓｔｕｄｙ软件行相对定量分析。检测实验重复三次。　　１．２．６　ＭＴＴ细胞存活率检测　　三组细胞以１１０４个／孔接种于９６孔板，每组１０个复孔，各组随机选择５个复孔行ＯＧＤ１６ｈ，每孔加人２０μｌ的ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）３７℃孵育４ｈ后弃去培养液，加入２００μｌ的二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶，

7、充分振荡溶解，应用酶标仪在４９０ｎｍ激发波长测吸光度（Ａ）。ＯＧＤ１６ｈ的Ａ值与ＯＧＤ０ｈ的Ａ值比较，计算每组细胞存活率。检测实验重复三次。　　１．２．７　Ｓｍａｄ７和ＡｃｔＡ的蛋白水平检测　　神经元样ＰＣ１２细胞，经ＯＧＤ１６ｈ处理的阳性及阴性转染组细胞分别消化离心，利用含有１％ＰＭＳＦ的ＲＩ－ＰＡ裂解提取总蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，转膜，封闭，而后分别用兔抗大鼠Ｓｍａｄ７（１∶５００）和ＡｃｔＡ（１∶５００）一抗４℃过夜孵育，洗膜，羊抗兔二抗（１∶５００）３７℃孵育２ｈ，ＥＣＬ显影压胶片。　　

8、１．３统计学分析　　应用ＳＰＳＳ１０．０软件包，计量资料用ｘ珚±ｓ描述，均数间比较采用独立样本ｔ检验，多个均数比较采用单因素方差分析，Ｐ＜０．０５视为有统计学意义。　　２结果　　２．１　Ｓｍａｄ７ｓｉＲＮＡ沉默效果检测　　应用Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ的表达变化，阳性转染组Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ表达水平（０．３２±０．１３）较阴性转染组显着下调（０．６８±０．１４）（见图１）。　　　　２．２　Ｓｍａｄ７