国内外干细胞的发展、标记及示踪技术总结

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1、国内外干细胞的发展、标记及示踪技术总结　　近年来，随着医学的发展，人们发现传统方法只能使许多器官损伤疾病减轻其并发症，不能从根本上解决疾病的根本问题，患者的健康水平和生活质量、精神状态都遭受严重的威胁。医学的进步需要研究新的临床治疗手段，干细胞应用于疾病的治疗研究，为临床事业带来良好的应用前景，并且得到了越来越多研究的证实，动物实验及临床试验已取得令人鼓舞的研究成果。但是，干细胞在疾病治疗用途中真正起作用的机制至今不明，干细胞的标记方法及示踪技术没有明显的突破性是其原因之一，为了更好地了解干细胞在机体内的迁徙途径，本文对国内外干细胞的发展、标记及示踪技术进行了回顾和总结，为

2、干细胞的基础研究及作用机制的揭示起一定的支撑作用。　　1干细胞的标记及示踪技术　　1.1基因转染标记法　　在干细胞上标记转染基因，检测干细胞移植后的生物学特性。绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）标记干细胞在实验中尤为常见。GFP不需要与其他物质合作，只需要用蓝光照射，就能自我发光。GFP的荧光稳定，易于构建载体、可进行活细胞定时定位观察、在许多动植物中都能够表达成功并发出荧光，可用显微镜呈像技术方便地在活细胞中检测，适用与其他荧光试剂同时进行双标实验。　　GFP对干细胞进行标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与，即可在活细胞或动物中进行有

3、效地标记，GFP已成功地靶入了大部分细胞器中[1].目前，GFP的具体半衰期还未知，不利于在实验中对时间的掌控，并且一些物理因素如高温等；化学因素有强酸等可以破坏它水化层或双电层，对其进行降解。　　1.2荧光染料标记法　　干细胞移植前，使用荧光素进行预先标记，移植后利用荧光显微镜观察荧光标记的干细胞的迁徙情况，目前以Dil的衍生物CM-Dil的标记更为高效。CM-Dil通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞，有着强而稳定的红色荧光，它容易嵌进生物质膜内并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞，是目前最好的荧光染料[2].CM-Dil标记细胞后再进行各种操作都不会影响其荧光，是免

4、疫荧光组化和原位杂交中理想的细胞荧光标记染料。CM-Dil标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率高，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况[3].但是，CM-Dil是通过细胞膜进行标记，随着细胞的分裂增殖造成荧光的指数级衰减，使其很难维持长时间的高标记率。　　1.3荧光原位杂交标记法　　荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridiza-tion,FISH）方法，即制备DNA或RNA探针，通过原位杂交的方法，使特定的DNA或RNA序列在细胞或染色体上显示出来，使用荧光显微镜检测，最后对其结果进行分析。FISH技术[4]使用经济、增强了安全性，

5、简化操作流程、效率高和定位准确。多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列，既可以在载玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。荧光原位杂交技术对即时发现肿瘤和预后都有良好的指导作用。但是，该方法不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。　　1.4核酸标记法　　5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）是一种嘧啶类似物，与内源性胸腺嘧啶核苷竞争插入DNA中，经过免疫组化染色，跟随标记细胞增殖传代，反映细胞增殖并且跟踪检测移植细胞动态变化[5].核素标记法避免了放射性污染，安全性高，并且Brdu抗体不与胸

6、腺嘧啶发生交叉反应，对活体动物进行标记时，无任何不良反应。在研究干细胞体内移植后的分化时，更可采用双标法显示干细胞的其他特性。但是，Brdu标记存在着标记率不稳定的特点，随着标记时间的增长，细胞的凋亡，吞噬细胞的吞噬作用，周围细胞也可能会被Brdu标记，移植细胞标记强度降低或丢失，从而很难测定出真正需要检测观察的干细胞。　　1.5磁共振成像技术　　磁共振（NuclearMagicResonance,NMR）活体示踪SPIO细胞已经成为新的研究热点。在体外使用SPIO对干细胞进行标记，经过转染剂修饰后进一步提高细胞的有效磁标记率，含铁颗粒即可进入移植细胞内，标记率可达到99%

7、[6].在一定的浓度范围内，铁颗粒对细胞的活性没有明显的影响，然后利用磁共振成像对干细胞进行追踪，根据其位置的改变和信号的衰减从而判断干细胞的增殖、移行和空间分布情况，SPIO纳米颗粒标记技术逐渐成熟[7].但是，实验过程中，细胞增生分裂死亡，氧化铁微粒会残留在死亡的组织内或者被巨噬细胞吞噬，会导致标记敏感性下降，造成假阳性结果，同时，需要考虑氧化铁造影剂颗粒对机体所产生的长期影响。　　1.6近红外荧光成像技术　　半导体量子点（QuantumDots,QDS）为现在广泛使用的近红外荧光材料，QDS具有宽而连续的吸收