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1、泰妙菌素完全抗原的研制与鉴别 动物源性食品中的抗生素残留问题已经引起世界各国的广泛关注,欧盟、美国等均对动物源性食品中的抗生素残留限量颁布标准。中国农业部在2002年的公告中规定92种兽药在动物源性食品中的残留限量。其中,泰妙菌素(Tiamulin,TML)在猪肉、鸡肉中的残留限量为100mg/g,猪肝中为500mg/g。 泰妙菌素是一种截短侧耳素类动物专用抗生素,不仅对支原体有极强活性,对链球菌、金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌活性,因此作为兽药和饲料添加剂被广泛应用。但TML在动物体内的残留可能对人类的健康造成严重的潜在威胁。目前,用于检测泰妙菌素残留的方法主要有气相色谱
2、法、高效液相色谱法、气相色谱质谱联用法,这些仪器分析方法灵敏准确,但样品处理过程繁琐,耗时较长,且仪器价格昂贵。免疫学检测方法具有灵敏度高、操作简单、省时等特点,很适合大量样品快速检测,而针对TML的免疫学检测方法尚未报道。 TML属于小分子半抗原,相对分子质量仅为609.8,需要与大分子载体蛋白偶联后才能作为免疫原免疫动物。本研究根据TML的分子结构使用混合酸酐法和N,N-羰基二咪唑2种方法制备完全抗原并作鉴定、比较,对其完全抗原的制备作初步探讨。 1、材料与方法 1.1试验材料 1.1.1试剂与溶液 延胡索酸泰妙菌素,相对分子质量609.8,纯度≥98%,
3、购于百灵威;牛血清白蛋白,Sigma产品;吡啶、戊二酸酐(Glutarican-hydride)、1,4-二氧六环、N-N-二甲基甲酰胺、氯甲酸异丁酯、三丁胺、N,N-羰基二咪(1,1′-Car-bonyldiimidazole,CDI),AR级。 1.1.2主要仪器。 TP-214分析天平,美国Den-ver公司;Poo公司;CMAGHS4加热磁力搅拌器,德国IKA公司。 1.2方法 1.2.1混合酸酐法制备TML-HS-BSA 参照文献方法并作修改,取TML30mg溶于无水吡啶,加入戊二酸酐6mg,室温搅拌反应36h,氮气吹干吡啶,残留物为泰妙菌素戊
4、二酸酐半醛化合物TML-HS,用2mL体积比为1∶1的N,N-二甲基甲酰胺和1,4-二氧六环混合溶液溶解残留物,加入三丁胺14μL,冰浴搅拌反应15min,加入氯甲酸异丁酯8μL,室温搅拌反应2h,产物为TML活化物,取BSA10mg溶于3mL0.1mol/L的Na2B4O7溶液(pH8.5),4℃预冷30min,将活化物逐滴加入BSA溶液,室温搅拌反应24h,4℃磷酸盐缓冲液(PBS)中透析3d,制得TML-HS-BSA,-20℃保存,备用。合成路线见图1。 1.2.2N,N-羰基二咪唑法制备TML-C-BSA 参照文献方法稍作修改,取15mgTML溶于50
5、0μL无水四氢呋喃,加入15mgCDI,37℃反应45min,真空抽干四氢呋喃,残留物溶于2mL,加入5mgBSA的PBS溶液,室温条件下缓慢反应3h,4℃PBS透析3d,即得TML-C-BSA,-20℃保存,备用。合成路线见图2。 1.2.3完全抗原的表征与鉴定 偶联物蛋白质量浓度的测定:使用Solarbio考马斯亮蓝法蛋白含量测试盒测定偶联物蛋白质量浓度。具体操作:分别配制空白管、标准管、测定管溶液混匀静置10min后于595nm比色,其中空白管含0.2mL双蒸水、0.8mL考马斯亮蓝试剂,标准管含0.2mL50mg/L的标准蛋白溶液、0.8mL考马斯亮蓝试剂,
6、测定管含0.2mL待测蛋白溶液、0.8mL考马斯亮蓝试剂,测定前用1~2个样做预试验,确保蛋白质量浓度在0~100mg/L,否则应对蛋白做相应稀释。计算公式:C1=OD1C2/OD2,其中,C1为待测液质量浓度,C2为标准液质量浓度,OD1为待测液吸光值,OD2为标准液吸光值。蛋白溶液的最终质量浓度由该公式得到的结果扩大相应稀释倍数。 紫外扫描鉴定:用PBS配制相同质量浓度的TML、BSA标准溶液,同样用PBS调节TML-HS-BSA、TML-C-BSA溶液至相同质量浓度,在波长200~320nm进行紫外扫描,分析扫描结果。 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定及偶联比估算:参照
7、文献配制SDS-PAGE凝胶电泳所需各种溶液,浓缩胶电压为90V,分离胶电压为120V,上样蛋白质量为3μg,上样溶液体积为20μL,考马斯亮蓝染色2h,脱色10h,脱色后用凝胶成像系统拍照分析,之后用软件BandScan分析凝胶电泳图,由载体蛋白和偶联物蛋白的位置估算出偶联比。 2、结果与分析 2.1偶联物蛋白质量浓度 将测得的数值代入公式得到待测蛋白液质量浓度并作相应稀释倍数扩大,最终TML-HS-BSA的质量浓度为1.3g/L,TML-C-BSA的质量浓度为1.7g/L。 2.
