流动相改性剂全面覆盖尿液代谢物检测的有效策略

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1、流动相改性剂全面覆盖尿液代谢物检测的有效策略摘要：采用高效液相色谱飞行时间质谱（HPLC-QTOF-MS）对尿液进行代谢组学分析，在流动相中分别添加甲酸，甲酸铵，乙酸铵3种流动相改性剂来考察尿液中代谢物的覆盖范围、离子响应强度和分辨率。通过标准品和质控样品评价手段建立了适用于尿液代谢物分析的方法。在该方法基础上，在流动相中分别添加甲酸、甲酸铵、乙酸铵，正负离子模式下尿液中检测到的离子数分别为1452,1197,714和636,593,947.正离子模式下，添加甲酸后的离子质荷比范围最广为m/z340.0488±125.7661;负离子模式没有明显差别。在正、负离子模

2、式下，在流动相中添加甲酸和乙酸铵，代谢物覆盖率最高，且离子响应强度和分辨率有所提高。方法已应用于复合农药和壬基酚暴露的尿液代谢组学研究以及可能生物标志物的筛选。　　　　关键词：高效液相色谱串联相飞行时间质谱；代谢组学；尿液；流动相；改性剂；优化。　　　　代谢组学是了解机体内源性代谢物动态变化的重要平台，主要是针对各种代谢途径中内源性小分子化合物进行研究，进而筛选出有意义的生物标志物[1].丰富有效的代谢物数据是成功识别潜在生物标志物的先决条件。因此，增加样品中代谢物的覆盖率对于代谢组学发现生物标志物是尤为重要的[2].尿液是代谢组学研究中经常使用的生物样本[3].其中的内源性小分

3、子主要包括脂肪酸、氨基酸、糖类和有机酸等。它们的极性和化学结构差别很大，简单的分离方法不足以勾勒出其完整的代谢轮廓[4].　　　　在众多代谢组学分析技术中，HPLC-QTOF-MS由于其高通量、高分辨、软电离，及覆盖代谢物广的特点而被广泛使用[5].最常用的三种是反相液相质谱（RPLC）、正相液相质谱（NPLC）和亲水液相质谱（HILIC）[6].在这些方法中，反相液相质谱是使用最为广泛的。常用的色谱柱为C8和C18柱[7].常用的流动相包括水或甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等有机溶剂的混合物。最常用的改性剂包括甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵等。在对尿液样品进行代谢组学研究时，在甲酸和

4、乙酸的选择中，很多文献报道中添加了甲酸，而不是乙酸[8,9].因此本研究针对甲酸、甲酸铵和乙酸铵3种流动相改性剂进行对比。　　　　然而，至今没有系统的研究对RPLC中流动相改性剂进行评价。最近，有研究对碱性改性剂对RPLC分析尿液代谢物的影响进行了评估。0.05%氢氧化铵和1~5mmol/L甲酸铵（pH9.3~8.8）的混合物被认为是提高代谢组学研究中脂质覆盖率的首选[10].然而，由于目前的C18柱固定相在碱性条件下通常是不稳定的，经常导致分离要在低温下进行。所以在RPLC分析中使用酸或中性流动相可能是更具优势的。　　　　本研究考察了3种在RPLC尿液代谢组学中常用的流动相改性

5、剂，进行了3种流动相的总离子流色谱峰个数和检测到的离子数评价，碎片离子的响应强度评价，离子的MS/MS分辨率分析。结果表明，在正离子和负离子模式下分别使用甲酸和乙酸铵改性剂是实现尿液中代谢物更全面覆盖的有效策略。　　　　1实验部分。　　　　1.1试剂。　　　　乙腈、甲醇、甲酸、甲酸铵、乙酸铵（色谱纯）购自Sigma-Aldrich公司。标准品：脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、胞苷、组氨酸、苏氨酸、犬尿烯酸、5-羟色胺、酪氨酸、马尿酸、氢化可的松、雌酮色氨酸、胆酸、亚油酸15种尿液中常见物质购自Sigma-Aldrich公司（尿液常见化合物数据查自HMDB数据库）.超纯水由美国

6、Milli-Q超纯水系统净化。　　　　1.2生物样品制备。　　　　实验前将尿液样本在室温下解冻，保持4℃以12000r/min高速离心15min除去尿液中蛋白，用超纯水将尿液上清液稀释4倍避免浓度太高污染仪器，涡旋震荡1min,通过0.22μm水系滤膜过滤，装样品瓶待测。　　　　混标溶液的制备：选择1.1节中的在正负离子模式下均可出峰，并分布在不同保留时间段的15个标准品，分别称取15种标准品各5mg,分别溶于1mL甲醇或甲醇-水（1:1,V/V）,分别配制成单标溶液，然后取各单标溶液20μL混合配制成混标溶液，用于色谱质谱条件的考察。　　　　质控样品（QC）的制备：

7、将30例处理后的尿液样本各取100μL涡旋震荡混合，取1mL装样品瓶待测。上机检测时，以5个QC样品开始序列，然后每5个待测样品间穿插一个QC样品，再以5个QC样品结束序列。　　　　1.3色谱及质谱条件。　　　　使用安捷伦1200系列高效液相色谱仪（美国Agilenttechnologies公司）,Pa,雾化气（GS2）为0.345MPa,气帘气为0.138MPa,离子源温度为500℃，聚焦电压为265V/-265V,去簇电压为80V/-80V.采用AnalystQS2.0