电针内关穴对内毒素休克肾组织诱导型no合酶表达的影响

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1、电针内关穴对内毒素休克肾组织诱导型NO合酶表达的影响　　关键词：休克，脓毒性／针灸疗法；肾／针灸效应；一氧化氮合酶／针灸效应；穴，内关；疾病模型，动物　　一氧化氮(NO)为小分子气体物质，在体内极不稳定，其生物半衰期仅为4s，广泛参与体内的生理及病理活动。生物体内NO是由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)以左旋精氨酸(Larginine)为底物而生成的。因此，NOS是NO合成的关键因素。NO过度生成则是细菌细胞壁中的脂多糖(LPS)成分诱导的内毒素休克的重要发病环节［１］。内关穴为中医针刺抗休克的常用有效穴位之一［２］，本实验从NOS角

2、度，探讨电针内关穴对内毒素休克肾的保护作用，为临床治疗内毒素休克提供新的治疗方案。　　1材料和方法　　11材料　　健康普通级SpragueDaa产品；兔源大鼠诱导型NOS(iNOS)单抗、链霉素亲和素生物素复合物法(streptaridinbiotinplex,SABC)免疫组化试剂盒、联苯二胺(DAB)试剂盒，武汉博世德生物工程有限公司提供。　　12分组及处理措施　　24只大鼠随机分成模型组、电针内关组，每组12只。动物于实验前12h禁食，自由饮水，实验时腹腔注射水合氯醛(03mL/kg)麻醉，右颈总动脉分离，插PE50管，BL410生理仪观察并记录血压变化。　

3、　待10～20min血压稳定后，记录血压并定为记录0点，各组于尾静脉注射LPS15mg・kg－１，腹腔注射D氨基半乳糖(ＤGalN)100mg・kg－１，30min后电针“内关”穴。取穴方法按骨度分寸定位法，电针频率20Hz，持续脉冲电流，强度以双上肢规律性抖动为准，电针30min。　　13iNOS免疫组化反应　　131切片制备　　开胸，经升主动脉插管，先用生理盐水150mL冲去血液，继而灌注含40g/L多聚甲醛的01mol/L的磷酸缓冲液(PB，pH74)350mL，注毕立即取肾置于相同的新鲜灌注液中固定至组织块沉底，洗去表面的固定液

4、，再取材，继之梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，石蜡切片，片厚10μm。　　132iNOS免疫组化反应(SABC法)　　(1)先烤片，恒温烤箱内60℃放置1h；(2)梯度脱蜡、脱水，PBS洗；(3)置于新鲜的体积分数为3%Ｈ２Ｏ２中10min灭活内源性过氧化物酶，双蒸水洗；(4)切片置于001mol／L柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复25min；(5)冷却后，滴加抗原修复液，30min后，双蒸水洗；(6)滴加正常山羊血清60min，不洗，甩去多余液体；(7)滴加兔抗鼠iNOS一抗(1∶２０００，Sigma)，室温下(25℃)孵育1h，再4℃过夜，PBS洗；(8)

5、滴加生物素化山羊抗兔IgG(博士德二抗试剂盒)，室温下60min，PBS洗；(9)滴加试剂SABC，室温60min，PBS洗15min×4次；(10)DAB显色，室温下20min，双蒸水多次洗涤；(11)脱水、透明，中性树胶封片。上述未提及的洗涤时间均为10min×３次。　　133免疫组化染色对照　　同一组切片中，分别用正常山羊血清和PBS代替iNOS一抗作孵育，其余步骤同上，用以检查iNOS免疫反应的特异性。　　14结果分析　　每只动物随机选10张切片，切片在统一放大倍数(1×40)下，合计其阳性细胞数。所得数据用SPSS软件进行统计学处理。　　2结果　　21内

6、毒素对肾组织iNOS表达的诱导作用　　iNOS阳性细胞均为胞浆染色，胞核不着色，对照反应未见阳性染色细胞。内毒素对照组iNOS阳性细胞数量多，肾小球毛细血管、肾小囊、肾间质血管内皮细胞质中iNOS免疫组化染色呈深棕褐色；肾近端小管管壁上皮细胞呈锥体形，细胞界限不清，胞浆呈深褐色而均匀；肾远端小管管壁上皮细胞呈立方体，细胞间界限清楚，胞浆亦呈深褐色而均匀，为iNOS强阳性表达(见表1、图1-a)。表1两组肾组织iNOS免疫阳性细胞数比较（略）　　3讨论　　内毒素的化学本质是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖(LPS)成分，进入宿主血循环的内毒素，可激活全身的防御系统，包

7、括血浆因子(补体和凝血因子)和细胞(中性粒细胞、单核巨噬细胞及内皮细胞)，而活化的细胞产生大量的NO导致严重的低血压反应［３］，这种逐步扩大的免疫反应和低血压引起的组织灌流不足最终导致多器官衰竭乃至死亡［4］。内毒素(LPS)刺激的NO过度产生为内毒素休克病理发生中关键性的中介机制。人对LPS十分敏感，但宿主为大、小鼠时，则敏感性很低，主要因其肝脏解毒功能较强，故本文造模时合用DGalN，引起一定程度的肝损伤，则可复制出内毒素休克模型。　　31内毒素诱导肾组织iNOS过度表达　　NO是一种自由性质的气体，为较小的生物活性分子，可自由穿过细胞膜，作用于细胞内的靶分子

8、。NOS是