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《鲈鱼豚鼠气单胞菌的生物学特性和耐药性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、鲈鱼豚鼠气单胞菌的生物学特性和耐药性研究 鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)属鲈形目,真鲈科,因具有肉质鲜嫩、营养丰富、药用价值高、经济效益好等特点而被广泛养殖于各水产区.关于鲈鱼的研究主要集中在其含肉率、营养成分、新鲜度及野生群体的遗传多样性等方面.有关鲈鱼病原菌已报道的有诺卡菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维弧菌,但尚未见鲈鱼豚鼠气单胞菌病的报道[1-4].豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)属弧菌科、气单胞菌属,可引起人类急性腹泻、败血症、膀胱炎、胆囊炎等[5-7].近年来,
2、国内外研究者已从熊猫、红嘴鸥、虎纹蛙蝌蚪、金鱼、鲤鱼、虹鳟、欧洲鳗鲡、鲢鳙、丰产鲫、南方鲇等多种患病动物中分离出该菌[8].本研究从发病鲈鱼中分离到豚鼠气单胞菌,并对该菌的生物学特性和耐药性进行了研究,这将为鱼类豚鼠气单胞菌的鉴定及水产动物疾病的诊治提供科学依据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料发病的鲈鱼采集自成都市某养殖场,体长24cm,体重400g.体表鳞片少量脱落,胸鳍、腹鳍和尾部轻微出血,肛门轻微红肿.腹腔内有淡黄色液体,肝脏严重充血. 1.1.2试剂和仪器普通营养琼脂、T
3、SA-YE琼脂、SS培养基、生化鉴定管和药敏纸片,杭州微生物试剂有限公司产品;TaqPCRMasterMix,天根生化科技(北京)有限公司产品;PCR仪(EppendorfGermany)、电泳仪(BIORAD)、凝胶成像系统(Bio-RADLaboratoriesSegrateItaly)、恒温培养箱,购自上海齐欣科学仪器科技有限公司. 1.2方法 1.2.1细菌分离无菌操作下取发病鲈鱼的肝脏划线接种于普通营养琼脂、TSA-YE平板和SS培养基上,28℃培养24h.挑取单菌落多次划线纯化培养,
4、纯化后的菌株于4℃保存.再将纯化菌株分别划线于新的上述3种平板,28℃培养,观察菌落形态特征,并挑取单菌落经革兰染色后镜检. 1.2.2生理生化鉴定将上述纯化菌株穿刺接种于细菌生化鉴定管中,参考《伯杰氏系统细菌学手册》对菌株进行系统的理化特性的测定. 1.2.316SrDNA基因的扩增DNA模板制备:挑取纯化后的单个菌落于60μL的灭菌ddH2O中,-80℃冻存55min后,迅速置于100℃沸水浴15min,之后12000r/min离心5min,取上清液为粗提DNA模板.16SrDNA通用
5、引物上游:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG-3′,下游:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.PCR反应体系50μL:上、下游引物各1μL(引物浓度均为10μmol/L),DNA模板4μL,TaqMix25μL,ddH2O19μL.PCR反应程序:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环;最后72℃4min.扩增
6、产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品送上海生工生物工程技术服务有限公司测序. 1.2.4系统发育树构建通过NCBI的Blast系统将菌株SCLL2的16SrDNA序列与GenBank库中的序列进行同源性分析,将相似性较高的菌株及同属菌株作为内群,另选取弧菌(Vibrio)和邻单胞菌属(Plesiomonas)作为外群,利用Clustalx1.83软件进行多序列比对,并结合MEGA5.0软件中的邻近法(NeighbourJoining)和采用JukesCantormodel矫正模型,自举10
7、00次构建系统发育树. 1.2.5药敏试验选用强力霉素、庆大霉素、先锋V、诺氟沙星等20种药物对菌株SCLL2作药敏试验.采用Kirby-Bauer扩散法,将0.5麦氏单位(1.5108CFU/mL)的菌悬液均匀涂布于普通营养琼脂平板,贴上药敏纸片,于28℃恒温培养20h~24h后观察抑菌圈的大小,依据美国临床实验室标准化委员会执行标准判定结果. 2结果 2.1细菌分离 经过多次纯化得到一株优势菌株,命为菌株SCLL2,该菌株在液体培养基中表面有薄菌膜.在营养琼脂培养基和TSA-YE琼脂上菌
8、落呈圆形、灰白色、半透明、中央稍隆起、表面光滑湿润、边缘整齐.在SS琼脂上可生长,呈无色菌落.该菌经革兰染色后呈阴性,短杆状,两端钝圆,单个散在或成对分布. 2.2生理生化特性 该菌株具有动力性,产生H2S,分解半乳糖、蔗糖和甘露醇,山梨醇、侧金盏花醇,MR和V-P试验为阴性,氧化酶和接触酶阳性.其他特性见表1.参考《伯杰氏系统细菌学手册》,初步判定其为豚鼠气单胞菌. 2.316SrDNA的扩增结果与系统发育树分析该菌株16SrDNA基因的扩增产物经10g/L琼
