池塘气单胞菌快速鉴定技术研究

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1、单位代碼10476学号1320281008分类号S94硕士学位论文(专业学位）池塘气单胞菌快速鉴定技术研究专业学位领域：渔业专业学位类别：农业推广硕士申请人：陈颖指导教师：李莉副教授二〇一五年五月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。作者签名:减、麵円肌如Ml关

2、于论文使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）THERAPIDIDENTIFICATIONTECHNOLOGYRESEARCHOFAEROMONASINAQUACULTUREPONDADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanN

3、ormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgriculturalExtensionByChenYingSupervisor:Prof.LiLiMay，2015III摘要气单胞菌属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），气单胞菌目（Aeromonadales），气单胞菌科（Aeromonadaceae），气单胞菌属（Aeromonas），属革兰氏阴性菌。气单胞菌属细菌是淡水养殖中一类常见的病原菌，能引起多种水产动物致病，导致出

4、血、溃疡和甲壳变软等不同的症状。本研究探讨了气单胞菌的快速鉴定方法，对池塘环境中气单胞菌的生态分布进行了初步分析。主要结果如下：1.建立了一种气单胞菌快速分离鉴定方法。使用ADA（Ampicillin-dextrinagar）培养基，对养殖池塘中的气单胞菌属细菌进行选择性培养，分离的菌株经氧化酶和葡萄糖氧化发酵两项指标检测的初步筛选，使用气单胞菌属特异性引物（gyrB基因）筛选获得气单胞菌267株。在此基础上，经16SrRNA-RFLP方法得到不同气单胞菌分离株的酶切图谱，选取代表菌株进行16SrRNA序列测定，最终得到样品中不同气单胞菌类群的比例

5、。结果显示共分离到维氏气单胞菌（A.veronii）、温和气单胞菌（A.sobria）、豚鼠气单胞菌（A.caviae）、易损气单胞菌（A.trota）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）、中间气单胞菌（A.media）等7个种类，其中维氏气单胞菌所占比例最高，达90%以上。2.建立一种用于区分弧菌属和气单胞菌属细菌及嗜水气单胞菌快速诊断的多重PCR方法。使用气单胞菌属gyrB基因、嗜水气单胞菌16SrRNA、弧菌Vlb基因的特异引物对相关细菌进行鉴别，结果显示气单胞菌属和弧菌特异性引物能够将气单胞

6、菌属细菌和弧菌区分开来，而嗜水气单胞菌特异性引物能特异性检测出嗜水气单胞菌。该方法对嗜水气单胞菌DNA的最低检测浓度为5.6-3ng/µl，对霍乱弧菌的最低检测DNA╳10浓度为9.6-3╳10ng/µl，气单胞菌属细菌的最低检测浓度为0.56ng/µl。3.对维氏气单胞菌进行分型研究，并检测其毒力基因。采用ERIC-PCR方法对77株维氏气单胞菌进行基因分型，结果显示实验菌株均能扩增出2~4条主要条带，条带大小介于1000~4000bp，呈现出一定的多态性。77株维氏气单胞菌可基本分为3大群6小类。使用普通PCR方法检测维氏气单胞菌分离株的毒力基

7、因，结果显示被检维氏气单胞菌菌株33.3%具有外膜蛋白（omp）基因，89%具有丝氨酸蛋白酶（ahp）基因，而肠毒素基因（alt）的检出率为2.7%。I本研究建立的气单胞菌鉴别方法，为追溯养殖环境中病原气单胞菌的来源奠定了基础，将对指导生产上快速诊断气单胞菌引起的疾病和疾病早期预警提供理论依据。关键词：气单胞菌，分离鉴定，ERIC，多重PCRIIABSTRACTMembersofthegenusAeromonasaregram-negativebacteria,belongingtoGammaproteobacteria、Aeromonadales

8、、Aeromonadaceae、Aeromonas.Aeromonasbacteriaisakindofimportant