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1、白藜芦醇对于异抗原刺激下大鼠T淋巴细胞活化增殖的影响【关键词】白藜芦醇;异抗原;T淋巴细胞增殖活化 白藜芦醇(resveratro,RSV)含芪类结构的非黄酮类多酚化合物，主要于蓼科植物虎杖的根茎提取物，具有广泛的生理药理学作用，但对免疫系统的调节作用研究较少，我们初步探讨了RSV对异抗原刺激下T细胞活化、增殖与分化的抑制作用。 1材料 1.1试药与仪器白藜芦醇、大鼠IL-2ELISA检测试剂盒、胶原酶均购自Sigma公司;GIBCO1640培养基购自Invitrogen公司;酶标仪，BMG公司产品;细胞培养箱，Heraeus公司产品。 1.2动物供体采用健康纯系清洁级SD
2、大鼠，体质量约180～220g，雌性，购于西安交通大学动物实验中心;受体选用健康纯系清洁级I1640培养液将细胞配成5×106/ml的细胞悬液备用,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育。 2.2.3大鼠心肌细胞原代培养及模型建立[1]无菌解剖供体系SD大鼠心脏，经Langendorff灌注架37℃连续灌注无钙台氏液60ml,消化酶30ml循环灌注12min，再用含0.06mol/LCa2+的台氏液60ml灌注。在含100μmol/LCa2+的KB液中剪碎心脏，37℃轻摇10min，200μm滤网过滤，将滤液900r/min离心1min，弃上清，加入含500μmol/LCa2+
3、的KB液900r/min离心1min，再用含1mmol/LCa2+的KB液重复1次,用差速贴壁分离法纯化并于血细胞计数板上计数,1640完全培养液调细胞浓度为2×107/ml。分两培养瓶，其中一瓶内加入丝裂霉素(25mg/ml)去增殖活性备用。 2.2.4大鼠脾细胞悬液加入经丝裂霉素处理的大鼠心肌细胞共培养用1640完全培养液配成1×106/ml的大鼠脾细胞悬液100μl加入1640完全培养液调配成浓度为2×107/ml大鼠心肌细胞培养液100μl，加IL-2(20U/ml)加双抗(青霉素100mg/L,链霉素100万U/L)。 2.3实验分组每孔加入不同浓度RSV、CSA培养
4、,A:空白;B:CSA100nmol/L;C1:RSV50μmol/L;C2:RSV100μmol/L;C3:RSV25μmol/L;D:CSA100nmol/L,RSV50μmol/L;E:CSA100nmol/L,RSV37.5μmol/L。 2.4实验组内加入不同干预药物共培养细胞中T淋巴细胞增殖抑制率各试验组共培养5d后。吸取细胞悬液，离心收集上清液,置-20℃冰箱保存备用,进行IL-2活性测定，分离淋巴细胞，RPMI-1640不完全培养液洗涤2次,加入RPMI-1640不完全培养液5ml,将淋巴细胞悬液通过尼龙柱除去B淋巴细胞，贴壁法去除单核细胞，完全培养液配成5×10
5、6/ml,设阴性对照孔(RPMI-1640不完全培养液)，每孔反应总体积100μl，每孔设4个复孔，每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml),培养4h,然后加入DMSO150μl,充分振荡后,全自动酶标仪490nm波长进行比色分析，测定此波长下的光密度值OD值，T淋巴细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白OD)/(阴性对照组OD值-空白OD)]×100%。 2.5IL-2活性的测定无菌制备活的正常未手术I1640配成0.5×105/ml细胞悬液,作为检测IL-2活性的反应细胞。 取-20℃保存的IL-2上清液,并做1/2和1/4的稀释,在96孔平底培养板中,每孔加入
6、IL-2上清液或不同稀释度的IL-2的上清液100μl及上述作为反应细胞正常未手术TT(5mg/ml)10μl,继续培养4h吸100μl上清液,加入酸化异丙醇100μl(0.01mol/L),充分振荡10min后,全自动酶标仪用560nm波长进行比色分析。 4讨论 异位腹腔心脏移植是一种简便、实用、有效的观察排斥反应发生机制的动物模型，一直用于器官移植后的免疫排异反应研究。SD与HC抗原(主要组织相容性抗原)不一致时，它们作为抗原呈递细胞(Antigenpresentedcells，APC)激活T辅助(Th)细胞,同时释放IL-1,进一步激活Th细胞,出现增殖,分化,产生细胞毒
7、T细胞(CTL)破坏心肌细胞,产生效应T淋巴细胞释放IL-2、γ-IFN、TNF等,促进心肌细胞表面表达MHC类抗原,MHC类抗原可被CTL识别而导致心肌细胞的破坏,MHC类抗原可激活Th细胞,促进T细胞增殖、分化,正反馈性加强上述反应,产生急性排异反应，最终结果为对心肌细胞的杀伤和淋巴细胞的大量增殖，模拟了体内急性排异反应过程[2]。 本实验也观察到该模型的确可引起T细胞增殖以及细胞因子的改变，达到了模拟心脏移植后体内急性排异反应的目的。CSA及RSV在本模型下可
