fak在机械压力诱导的气道黏液分泌的信号传导通路中的作用

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1、FAK在机械压力诱导的气道黏液分泌的信号传导通路中的作用　　临床中多种慢性气道炎性反应疾病(如COPD、哮喘等)往往伴有支气管收缩及重塑产生的气道狭窄，由此引发气道内压力增高，气道壁上皮细胞受压增加。而黏液高分泌作为这类疾病的突出病理表现，是疾病发生、发展及预后的重要影响因素。　　黏蛋白5AC(MUC5AC)是气道上皮尤其是病理状态下的主要黏蛋白表型，在气道黏液高分泌疾病中最具代表性。黏着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)能介导机械牵拉所导致的EＲK1/2活化。而EＲK1/2是已知的多种刺激因素诱导MUC5AC表达和

2、杯状细胞化生的关键性酪氨酸激酶。那么，FAK是否在机械压力诱导的气道黏液分泌的信号传导通路中起作用呢?该研究中以FAK为切入点，研究机械压力作用于气道上皮细胞所产生的对气道黏液分泌的调控作用及信号传导机制，以期探明机械压力在气道黏液高分泌调控机制中作用及其分子机制，为控制疾病状态下气道收缩狭窄状态提供新的思路。　　1材料与方法　　1.1主要试剂及材料　　正常人气道上皮NHBE细胞和BEBM培养基(均Cloics公司);DMEM培养基(Mediatech公司);Transa公司);脂质体Oligofectamine(Invitro-gen公

3、司);鼠抗MUC5AC45M1单克隆抗体(Neo-marker公司);鼠抗FAK单克隆、鼠抗FAK磷酸化位点多克隆(抗FAKTyr397)抗体、鼠抗磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-EＲK1/2)单克隆抗体、表皮生长因子受体(EGFＲ)阻断剂AG1478、p-EＲK1/2抑制剂PD98059(CellSignaling公司);PrimeScriptＲT试剂盒(大连宝生物公司);FastStartUniversalSYBＲGreenMaster(Ｒox)(德国罗氏公司);引物由(上海生工公司合成);FAKsiＲNA和对照siＲNA(Dha

4、rmacon公司)，FAKsiＲNA序列为:FAK1，NNGCAUGUGGCCUGCUAUGGA;FAK2，UUUGGCGGUUGCAAUUAAATT。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养:NHBE细胞接种于组织培养瓶中，加入支气管上皮细胞培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育，常规换液培养，当细胞汇合达70%～80%时传代，将培养好的2代或3代细胞接种到TransH2O压力作用于NHBE细胞，每天1h，连续7d，模拟慢性气道炎性性疾病中气道收缩时气道上皮细胞受到的慢性机械压力。　　1.2.3细胞分组:将形成气液相界面的NHB

5、E细胞分组处理:1)空白对照组:无血清培养基继续培养，不予任何刺激;2)机械压力组:细胞每天予以30cmH2O压力作用1h，连续7d;3)转染FAKsiＲNA对照组;4)机械压力+转染FAKsiＲNA组。　　在探讨EＲK1/2在机械压力诱导的MUC5ACmＲNA及蛋白表达中的作用实验中，采用EＲK1/2特异性抑制剂PD98059作为干预因素，将细胞分为以下4组:空白对照组、机械压力组、PD98059对照组和PD98059+机械压力组。　　在探讨FAKsiＲNA联合EGFＲ特异性抑制剂AG1478对机械压力诱导的MUC5ACmＲNA和蛋白表

6、达的影响的实验中，将细胞分为以下6组:空白对照组、机械压力组、AG1478对照组、AG1478+机械压力组、FAKsiＲNA+AG1478对照组和FAKsiＲNA+AG1478+机械压力组。　　1.2.4FAKsiＲNA、对照siＲNA转染:在转染前1天将处于指数增长期的NHBE细胞按(1～2)106个/mL的浓度在无血清条件下接种到培养板中，待细胞融合至40%～50%时进行转染。操作步骤按照脂质体Oligofectamine说明书进行。参照文献【9】，将FAKsiＲNA与PlusＲeagent在Opti-MEM培养液中结合。用Opti-

7、MEM培养液稀释的脂质体以10μg/mL的浓度进行转染。转染6～8h后，将0.5倍容积的含20%血清的ＲPMI培养液加入到细胞中继续转染48h。转染后24～48h于荧光显微镜下观察荧光，以此鉴定转染是否成功及转染效率。　　1.2.5实时荧光定量PCＲ检测MUC5ACmＲNA的表达:细胞总ＲNA提取及浓度、纯度鉴定按