白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌a549细胞株增殖和凋亡的影响

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1、白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响高宝安，陈世雄，杨俊，黄骥，邓红艳【摘要】　　目的探讨白花蛇舌草乙醇提取物在体外对肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT法测定不同浓度白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞增殖的影响；Hoechst33258检测白花蛇舌草乙醇提取物作用后细胞凋亡情况；流式细胞仪检测药物作用后的细胞周期和凋亡率；EM培养基稀释至所需浓度。碘化丙啶（PI）购于Pharmingin公司（晶美公司代理）。Hochest33258购于Sigma公司。鼠抗人Bax、Bcl-2及β-actin单抗购自美国SantaCruz公司。　　1.2

2、细胞及其培养　　肺腺癌细胞株A549购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，用含10％小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的DMEM培养基（Gibco公司），在含5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。　　1.3MTT试验　　A549细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为1×105ml-1，接种于96孔板，每孔100μl。分设对照组和不同浓度药物组（5，10，20，40，80mg/ml），每孔设6复孔，分别培养1，2，3，4d；每孔加入5g/LMTT10μl，继续孵育4h，每孔加入200μl二甲基亚砜（DMSO）终止，振荡15min，450型ELISA-Re

3、ader酶标仪（Bio-Rad公司）570nm主波长，630nm副波长检测吸光度。以对照组细胞活力为100％，按公式计算不同浓度白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞增殖的抑制率：细胞抑制率（%）＝(1－药物组吸光度/对照组吸光度)×100％　　1.4Hoechst33258染色检测细胞凋亡　　根据MTT实验结果，选择40mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作为后续实验药物浓度。将干净无菌的盖玻片置于六孔板内，接种细胞过夜。当50％～80％满时，加入白花蛇舌草乙醇提取物作用12，24，36，48h后，吸尽培养液，加入0.5ml的固定液，固定10min。然后去固定液，用PBS洗两次，3min/次，

4、吸尽液体，加入0.5mlHoechst33258染色液（1mg/ml），染色5min，晃动数次，封片，荧光显微镜下观察。　　1.5流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率　　将A549细胞接种于六孔板，待细胞生长至75％融合左右，对照组加入DMEM培养基，实验组加入白花蛇舌草乙醇提取物（40mg/ml），作用0，12，24，36，48h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后，80％冰乙醇固定，－20℃过夜。检测前PBS冲洗细胞1次，调整细胞浓度为106ml-1，加入含RnaseA（终浓度为0.25mg/ml）的碘化丙啶（PI）染色液（终浓度为5μg/ml）中，室温避光染色30min，流式细胞仪（购自B

5、echmanDickson公司）检测，每组重复3次，CellQuest及Motift软件分析SubG1峰和细胞周期。1.6蛋白免疫印迹试验（TT结果显示，不同浓度的白花蛇舌草乙醇提取物均能抑制肺腺癌A549细胞的生长，药物作用效果具有较明显的的时效和量效关系（见图1）。经观察，选择40mg/ml的药物浓度作为后续实验药物剂量。2.2Hoechst33258染色检测结果用Hoechst33258对白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞36h后的细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察发现，对照组活细胞所发荧光较弱，较均匀；经白花蛇舌草乙醇提取物作用36h后发生凋亡的A549细胞核明显变小，并可

6、见致密强荧光，可见凋亡小体。见图2。　　2.3白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞凋亡率和细胞周期的影响　　40mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作用于A549细胞12，24，36，48h，通过亚G1峰检测其凋亡率分别为（5.72±0.98）%，（7.10±2.08）%，（19.89±4.25）%，（32.55±6.51）%，与对照组细胞凋亡率相比，差异有显著性（P均0.05）。细胞周期检测结果显示，40mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞后，G1～G0期细胞百分比逐渐增高，从0h的（36.34±5.15）%，升高到48h的（64.94±7.56）%。结果见表1和图3。表140m

7、g/ml白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞周期和细胞凋亡率的影响（略）　　2.4〕.上海：上海科学技术出版社，1999：433.　　〔3〕赵浩如，李瑞，林以宁，等.白花蛇舌草不同提取工艺对抗肿瘤活性的影响〔J〕.中国药科大学学报，2002，33（6）：510.　　〔4〕TammI，SchrieverF，DorkenB.Apoptosis:implicationsofbasicresearchforclinicaloncology〔J