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1、第26卷第6期电子显微学报Vol226,No162007年12月JournalofChineseElectronMicroscopySociety2007212文章编号:100026281(2007)0620620205荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展张志毅,周涛,巩伟丽,张德添(国家生物医学分析中心,北京100850)摘要:荧光共振能量转移(FRET)是指两个荧光基团间能量通过偶极2偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体的现象,可被用于测定分子间的距离。FRET荧光探针主要有荧光蛋白、有机荧光染料、镧系染料和量子点
2、,近年来有许多新的应用;测试方法上与时间分辨、单分子检测、荧光寿命和荧光相关光谱等技术联用取得了更好的成效。关键词:荧光共振能量转移;荧光探针;单分子检测;荧光相关光谱++中图分类号:TG115121517;TG115133;Q331;Q336文献标识码:A蛋白质相互作用是当前生命科学研究的重大课吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶题,而荧光共振能量转移(fluorescenceresonance极2偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受energytransfer,FRET)技术是目前研究蛋白质相互作体分子,供体分子衰变
3、到基态而不发射荧光,受体分用比较成熟、已被广泛应用的几种方法之一。与其子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧他几种方法如免疫共沉淀、酵母双杂交及质谱等技光。这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence术相比,FRET方法的特点是适用于活细胞和固定细resonanceenergytransfer,FRET)。胞的各类分子,灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,113FÊrster共振能量转移最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,荧光共振能量转移其实包含两种主要机制。一因而受到广泛重视。近年来有关文献层出不穷。本种指的是供
4、体单重态与受体单重态之间的共振能量[3]文在介绍FRET原理的基础上简要回顾了近两年来转移,其机制最早由FÊrster阐明,因此被称为FRET方法的应用研究与进展。FÊrster共振能量转移(FÊrsterresonanceenergytransfer),由于其缩写也是FRET,且FÊrster共振能量1FRET原理简述转移是荧光共振能量转移的最主要机制,故这两个111荧光发射原理概念易被混淆。另一种机制是供体三重态与受体单物质在吸收入射光的过程中,物质分子吸收了重态之间的共振能量,其机制被称为德克斯特电子-15[1]传递机制[4]。
5、但其有效范围在110nm～115nm[5],光子的能量,在约10s时间内,其电子从低能级的基态跃迁到较高能级的激发态,根据其电子是就发生概率而言,1～10nm的距离中,FÊrster共振能否全部自旋配对,激发态可分为单重态和三重态[2]。量转移是主要途径,目前文献中的“FRET”,其含义处于激发态的分子不稳定,它可能通过辐射跃迁和多是用“FÊrster共振能量转移”指代了“荧光共振能非辐射跃迁的衰变而返回到基态。辐射跃迁的衰变量转移”,本文中也沿用了这一习惯。伴随着光子的发射,即产生荧光和磷光。由于非辐FÊrster推导出这个过程的效
6、率依赖于供体和受射能量损失,发射光子的能量一般小于吸收光子的体间距离六次幂的倒数:6能量,故而荧光物质的发射光谱波长要大于吸收光E=1P{1+(rPR0)}(1)谱波长。其中R0称为FÊrster半径,是指能量传递效率112荧光共振能量转移为50%时,供体与受体之间的距离。其依赖于染料如果两个荧光团相距在1～10nm之间,且一个的光谱特性及它们的相对方向,对于特定的体系和荧光团(供体)的发射光谱与另一个荧光团(受体)的能量供受体对,可以将R0看作恒量;r为供体与受收稿日期:2007205224作者简介:张志毅(1977-),男(汉族)
7、,山西省太原人,助理研究员.©1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net第6期张志毅等:荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展621体之间的距离;Styrer和Haugland给出:FRET探针建立了肠道病毒蛋白酶作用的检测方[17]E=1-IDAPID(2)法。IDA和ID分别是有受体和无受体时供体的荧光强212有机荧光染料[6]有机荧光染料种类繁多,应用广泛,可根据需要度,这样通过
8、测量供体的荧光强度可以算出E。R0的实验值(单位AÜ)可通过下式计算:选择适合的染料,并可以和其它类探针配对使用。3×10001P3Antia等通过Alexa488PAlexa594标记纤维素结合蛋R0=(3)4πN[A
