荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用.pdf

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1、荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用高裕锋分析化学B200425012摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的一些应用。核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET技术被广泛应用于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋白质相互作用。生命科学被誉为21世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。其中对于核酸和蛋白质

2、的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究中。荧光共振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成[1,2]为了生命科学领域的一个重要研究手段。本文简单介绍了基于FRET原理的新技术在生物研究中的一些应用。[3]一、FRET基本原理[4,5]FRET现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster创立了理论原理。FRET指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长距离能量转移。产生FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体

3、与受体间在合适的距离（1～10nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。图1产生FRET条件示意图FRET的效率用E表示，E用式（1）计算：其中R0为Foster距离，表示某一给定给体与受6R0E=（1）66R+R02-4R=const×k×n×f×J（2）0DDA体间能量转移效率为50％时的距离；R为给体与受体的实际距离。R0可由式（2）计算：其2中κ是方向因素,n是溶剂的反射系数,fD是供体探针结合到蛋白的量子效率

4、,JDA是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。由式（2）可看出R0对于给定的给－受体是一个特征值，因此，式（1）中E值与R的关系紧密，这也成为了FRET用于测定分子间或基团间距离的重要理论依据。E值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（E=1-IDA/ID，IDA表示A存在时D的荧光强度）；用量子产率表征（E=1-φDA/φD）；用荧光寿命表征（E=1-τDA/τD）。这表示研究FRET可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。随着成像技术的发展，用显微成像的方

5、法可更直观地观测FRET地发生。二、FRET探针FRET需要两个探针，即荧光给体与荧光受体，要求是给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定交叠，而与受体的发射光谱尽量无交叠。常用的探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机染料和镧系染料。[6]荧光蛋白是一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体，常见的有绿色荧光蛋白（GFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）等。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。荧光蛋白的突出优点是自身为生物分子，可有效地与目标分子融合，更易于在生物环境中使用，且

6、其种类多，可满足不同光谱需要。其缺陷是分子体积大，空间分辨率较低，且可能与目标分子作用产生化学发光，需要较长地时间来确定荧光形式，不利于动力学研究。为克服这些缺陷，常使用荧光蛋白与其他染料联用或用其他染料对来研究。传统有机染料是指一些具有特征吸收和发射光谱地有机化合物组成地染料对。常见的有荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。该类染料分子体积较小，种类较多且大部分为商品化的分子探针染料，因此应用较为广泛。[7]镧系染料一般与有机染料联用分别作为FRET的给－受体，其主要优点是：测量量可达10nm；与传统染料比准

7、确性和信噪比大大提高；对不完全标记的给体或受体样品不敏感。近年来，随着荧光量子点技术的发展，荧光量子点也被用于FRET探针中。荧光量子点的吸收谱带较宽，而发射谱带较窄且对称性好，并可有效避免光褪色，作为荧光给体与其他染料配对，显示较高的灵敏度。三、在生物研究中的应用FRET的应用一般基于对其产生影响的三个因素：距离、光谱交叠情况和偶极。基于距离的方法一般是预先标记上给受体后，由于化学作用产生了距离的变化，达到检测目的。该方法原理较为简单，只要探针不对体系产生大的影响，可达到较好的效果，也是目前最常用的方法。基于光谱交叠的方

8、法一般应用于发生化学反应后，分子自身结构发生变化，造成吸收光谱或荧光光谱的变化的体系，该方法对体系的选择要求较高，反应的机理不易把握。利用偶极取向变化达到检测目的的FRET技术对仪器和体系选择要求都较高，因此也较少使用。在生物研究中，常引入FRET探针来检测而不影响大分子的行为，因此检测机理多基于距离因