运用荧光共振能量转移（fret）技术研究cam和plk1的时空相互作用

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1、南京师范大学硕士学位论文运用荧光共振能量转移（FRET）技术研究CaM和Plk1的时空相互作用姓名：王盛申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：李朝军20070501硕L学位论文中立摘要中文摘要参与细胞周期调控的分子对细胞周期的调控存在两个层次上的四维控制：即在时间上对细胞周期特定事件次序上的调节和在空间上对细胞三维结构的调节。在前期的实验中，我们通过生物信息学筛选并综合运用免疫荧光染色技术、免疫共沉淀技术、酵母双杂交技术、激酶活性检测技术，发现Polo．Like激酶(Plkl)是一种CaM下游效应分子的候选蛋白质。并且CaM在有丝分裂中期与Plkl发生时空特异性分布，

2、并且以～种CaMKII非依赖的方式调控它的激酶活性，它们的相互作用促进了有丝分裂的进入。我们运用活细胞观察及荧光共振能量转移技术研究了不同时间段CaM与Plkl的相互作用，结果显示：CaM多种调控功能的发挥与其在细胞内的特异时空分布密切相关，它与Plkl激酶的相互作用是时间和空间依赖的，即在特定的细胞周期时段和特定的细胞空间上与Plkl激酶有直接的相互作用，并且这种相互作用随着细胞周期的运行而逐渐消失和产生。CaM与Plkl在问期细胞中不发生相互作用。共转荧光蛋白标记的钙调素和Plkl激酶，在细胞处于间期时分别在CFP通道、YFP通道、FRET通道以相同曝光时间成像检测Ca

3、M与Plkl的相互作用发现：在问期细胞中，CaM与Plkl没有直接的相互作用。CaM与Plkl在后末期细胞的中体附近存在直接相互作用。共转荧光蛋白标记的钙调素和Plkl激酶，在细胞处于后末期时分别在CFP通道、YFP通道、FRET通道以相同曝光时间成像并计算在中区纺锤体附近的FR、FRETR值。研究发现CaM与Plkl在后期细胞的中体附近存在直接相互作用。并且随着细胞进入末期，CaM与Plkl在空间位置上发生分离，CaM与Plkl的直接相互作用逐渐减弱。末期的细胞中，CaM与Plkl存在一定的相互作用，但随着两者空间位置上的分离，两者的相互作用逐渐减小以致消失。在两个子代细

4、胞完全分开后，CaM与Plkl没有相互作用。总之，CaM与Pu(1存在直接的相互作用，这种相互作用是时问和空间依赖的。关键词：CaM、Polo-like激酶1、荧光共振能量转移(FRET)，CFP／YFP硕士学位论文AbstractThecell—divisioncyclehastoberegulatedtemporallyandspatially．Thespatialdistributionsofcell—cycleregulatorsandtheirdynamicbehaviorsshowthattheirlocalizationareimportantintheres

5、ponsetospecificcell—cycleorcheckpointsignals，andhaveraisedthepossibilitythatregulatorsmaybeactivatedorinactivatedindiscretecompartmentsofthecell，oronspecificsubcellularstructurestocoordinatechangesinthesubcellulararchitecture．Calciumisauniversalsignalingmoleculeandinvolvedinregulatingmitmi

6、ctransitions．Inmammaliancells．calmodulin(CAM)isahighlyconservedCa2+bindingproteinthatcontMnsfourEF—handCa2+bindingmotifs．IntracellularCaMlevelsareregulatedasprogressingthroughthecellcycle．AlthoughCa2+／CaMisrequiredforproliferationinbothunicellularandmulticellulareukaryotes，theessentialtarg

7、etsofCa2+／CaM。dependentpathwaysrequiredforcellproliferationremainelusive．OurresultssuggestthatCaMcalldirectlyinteractwithPlklatspecifictimeandsubcellulararchitectureofcellcycle．Fluorescentresonanceenergytransfer(FRET)analysesshowthatininterphaseCaMcall’tdirect