qpcr检测敲减效率 实验方法

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1、qPCR检测敲减效率实验方法1/7实验流程描述培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养，感染当天按实验设计的组别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，感染5天后收集细胞，采用RT-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况，进而判断靶点的干扰效果。流程图2/7实验材料：1．主要试剂REAGENTSCOMPANYCat.No.TrizolInvitrogen15596-026M-MLV逆转录酶promegaM1705dNTPpromegaU124

2、0oligodT上海生工B0205RnaseInhibitorpromegaN2115Primer(R&F)上海吉凯SYBRMasterMixtureTAKARADRR041B胎牛血清GIBCOA11-102DMSO上海生物试剂厂DMEMGIBCO胰酶上海化学试剂公司双抗上海新先锋药业有限公司Opti-MEMGIBCO2．主要仪器EQUIPMENTSCOMPANYCat.No生物安全柜上海振梓创空气净化有限公司Bio1200-Ⅱ-A2荧光显微镜奥林帕斯公司micropublisher3.3RTVCO2培养箱日本三洋MCO-175稳

3、压电泳仪上海天能PCR仪器ABI公司2720thermalcyclerRealtimePCR仪器TAKARA公司TP8003/7实验设计：目的细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，每孔样品排列如下表所示：GroupScr-siRNAgene-siRNAresults-ΔΔCt2说明：1：Scr-siRNA为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组（NegativeControl）；2：gene-siRNA为正常目的细胞，加RNAi靶点病毒感染的细胞组（KnockDown）；实验步骤：1．准备靶细胞1.1细胞复苏1)从液氮罐中取出细胞冻

4、存管2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻3)完全解冻后，1000rpm，离心2min4)70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台5)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml含完全培养基的6-cmdish中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱培养6)次日更换一次培养液后再继续培养1.2细胞传代1)将生长90%汇合的细胞进行传代2)弃去旧培养液，加入2ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液3)加入1ml胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来

5、4)加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来5)混匀细胞后分至两个新的6-cmdish中，补足完全培养基至4ml，继续培养2．靶细胞慢病毒感染1)处于对数生长期的靶细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液4/752)将细胞悬液（细胞数约为2×10）接种于6-well中，37℃5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到10%~20%3)根据MOI值，加入适宜量的病毒4)12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基5)感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的

6、表达情况，感染效率大于50%者继续培养，待感染时间达到5天后收集细胞抽提RNA进行RT-PCR检测实验；感染效率低于50%的实验组，重新进行感染实验3．RealtimePCR3.1总RNA抽提（根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行）1)收集细胞，1000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mlTrizol，迅速吹打后室温静置5min，然后转移至新的1.5mleppendorf管中2)每管加入200µl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min3)4℃，12000rpm，离心15mi

7、n4)吸取上清移至新的1.5mleppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃沉淀10min5)4℃，12000rpm离心10min后，去上清6)加入至少1ml75%乙醇（用DEPC处理过的水新鲜配制），洗涤沉淀7)4℃，10000rpm离心5min，弃去大部分上清8)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去上清9)室温干燥10)待RNA基本透明时，加入20µlRNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度3.2RNA逆转录获得cDNA（根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行）M-MLV

8、逆转录酶和dNTP购自Promega公司，OligodT购自上海生工，RNase-free的物品都购自Axygen，具体步骤如下：1)将1µlOligodT(0.5µg/µl)和2.0µgTotalRNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O至9