qPCR实验操作流程复习进程.doc

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1、Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1mlTrizol（Invitr

2、ogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlRNasefreeEP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1mlTrizol（Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNasefreeEP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸

3、取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。4）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。三、去基因组使用R

4、Nase-free的DNaseІ（Promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。RNADNaseІ10xbufferH2O(RNasefree)RNasin30201039.50.5µlµlµlµlµl总体积100µl然后按以下步骤操作：1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20℃静置15min；4）4℃下，14,000g离心15min，收

5、集RNA沉淀，去上清；5）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干；6）加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1）纯度检测：取1μlRNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2）总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5srRNA，18srRNA和28srRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1.mRNA：1)在RNasefr

6、ee的PCR管中配置下列溶液.TotalRNAH2O1.0µgµl总体积12µl 1)将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；2)在该PCR管中加入下列试剂（Promega）oligo（dT）Randomprimer10mMdNTPRNaseinhibitor5xbufferM-MLV0.50.52.00.54.00.5µlµlµlµlµlµl总体积8.0µl3)将上述20μl反应溶液30℃保温10min；4)42℃保温50min；5)85℃保温10min；6)-20℃保存。2.microRNA：使用茎环逆转录法，原理如下图：1）在去R

7、Nase的PCR管中配置以下溶液.totalRNAX个miR逆转录引物H2O1.00.5*Xµgµl总体积12.5µl 2）将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mMdNTP(promega)RNaseinhibitor(promega)U6逆转录引物5xbufferM-MLV(promega)2.00.50.