正文描述:《qPCR操作步骤》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
QPCR(Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem)即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。标准的两步法:RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-timePCR.注意:1高质量的RNA获取,这里的高质量不是强调RNA降解,而是强调RNA的纯度,不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高,给你错误的结果,所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理,消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制real-timePCR的反应,导致扩增失败,给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键,一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短,150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因,所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解,所有的RNA以同样的速度降解,而相对比率不会改变。2减少加样误差,在使用SYBRGreenMIX的时候,一定要先按照反应的量(比如8个孔)把所有的试剂一次性配成MIX然后分装,留出5微升的反应体系给模板,使用5微升是因为只有5微升以上,加样枪的误差才会比较小,如果你仅仅是吸取一微升的话,手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差,严重影响你的定量精确度。3选择合适的内参基因,一般用于定量PCR的内参基因有好几种,但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞,比如不同组织来源,或者是动物等等,内参基因会有差异,最好的办法是,在你的样品上先测试内参基因,找到变化最小,最稳定的一个。4合适的引物设计,避免出现引物二聚体,非特异性扩增等。Q-PCR实验流程:一、①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1)细胞样品用1*PBS洗2次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1mlTrizol(invitrogen)溶液,吹打混匀,并吸至1.5mlRNasefreeEP管中使细胞充分裂解,室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,加入1mlTrizol溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称); 2)加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;3)4℃下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNasefreeEP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)4)沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;5)4℃下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4℃下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀),去上清;6)用75%乙醇洗涤两次,1ml/次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNaseІ(Promega),按以下体系配置反应液,37℃消化30min,65℃灭活10min。RNA DNaseІ 10xbuffer H2O(RNasefree)RNasin30201039.50.5µlµlµlµlµl总体积100µl然后按以下步骤操作:1)加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,000rpm,离心15min,取上清。2)加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。3)加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20℃静置15min;4)4℃下,14,000g离心15min,收集RNA沉淀,去上清;5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。 四、总RNA纯度和完整性检测1)纯度检测:取1μlRNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。2)总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5srRNA,18srRNA和28srRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1.mRNA:1)在RNasefree的PCR管中配置下列溶液.TotalRNA H2O1.0µgµl总体积12µl2)将上述溶液吹打均匀,置85℃保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷,以防止RNA复性;3)在该PCR管中加入下列试剂(Promega)oligo(dT)Randomprimer 10mMdNTP RNaseinhibitor 5xbuffer M-MLV0.50.52.00.54.00.5µlµlµlµlµlµl总体积8.0µl4)将上述20μl反应溶液30℃保温10min;5)42℃保温50min;6)85℃保温10min;7)-20℃保存。2.microRNA:使用茎环逆转录法,原理如下图:1)在去RNase的PCR管中配置以下溶液.totalRNAX个miR逆转录引物H2O1.00.5*Xµgµl总体积12.5µl 2)将上述溶液混匀,85℃孵育5min,以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构;3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:10mMdNTP(promega) RNaseinhibitor(promega)U6逆转录引物5xbuffer M-MLV(promega)2.00.50.54.00.5µlµlµlµlµl总体积7.5µl4)将3)溶液加入到1)溶液中,混匀后30℃保温10min;5)42℃孵育50min;6)85℃孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1.引物测试:根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率,具体反应体系和反应条件如正式实验,每对引物需做模板水对照。得到结果后,首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为:单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好,则应对比各引物的扩增曲线,优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2.确定上机内容后,先在记录本上编排好上机的样品排放顺序:(1)一个样品的加样尽可能安排在同一行(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,则需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板(3)正式实验:总体积15ul的体系配制:H2O4ulSYBRGreenPCRMasterMix10ul(TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物0.5ul(10uM)下游引物0.5ul(10uM) 一般多配0.5份--1份体系,总的体系配好后,在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀,然后15ul每管分装至8连管中。3.cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为1:20稀释,如遇到基因表达低的样品,则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕,盖好八连管盖,并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上,八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧,否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)4.把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。5.上机:5.1先开电脑,进入Windows界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2打开7500软件,选择“新建”,在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”(普通基因检测为“60”,MicroRNA检测为“65”)5.3打开样品架,放入八连管,关上样品架,并在软件上选择已放反应管的孔位,剔除无反应管的孔位。5.4点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写,如100830-1008-WL表示8月30日10点08分**的实验。5.5点击Start键,开始运行程序。5.6程序运行完毕后,取出样品架上的八连管,按顺序关闭ABIPRISM7500SDS软件、PCR仪电源开关。5.7在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称,分类保存好结果文件。反应完成后,八连管应装到封口袋中,袋子上标记好文件名,客户的名字。(同一个客户的三次重复实验,则只需保存其中一次重复的反应管即可,其余可丢弃)
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