非糖基化尿激酶原突变体的研究

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1、KKME---专业医学搜索引擎http://www.kkme.net/非糖基化尿激酶原突变体的研究作者:杨波,李天德,王广义,陈练作者单位：1解放军总医院心内科北京市；2西藏军区总医院心内科，西藏拉萨市【摘要】　　目的：构建一种非糖基化、抗凝血酶激活的尿激酶原突变体，在CHO-dhfr-（二氢叶酸还原酶缺陷型-中国仓鼠卵巢）细胞中表达，收取无血清培养上清，并鉴定其活性。方法：使用PCR扩增的方法，将302位天冬酰胺（Asn302）突变为丙氨酸（Ala302），去掉糖基化位点；将156位精氨酸（Arg156）突变为赖氨酸（Lys156），去掉凝血酶

2、作用位点。将突变体基因转染到CHO-dhfr-细胞中。收取无血清培养上清，并用纤维蛋白板溶解圈法鉴定活性。结果：PCR产物经琼脂糖电泳鉴定分子量略大于1200道尔顿(dalton)，与理论分子量1296道尔顿符合。转染成功的细胞株用于扩大培养。纤维蛋白板溶解圈法测定上清活性为29558IU/ml。结论：非糖基化、抗凝血酶的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂突变体构建成功。转染后细胞生长良好，表达水平较高。【关键词】尿纤溶酶原激活物；凝血酶；糖基化　　Studyforannon

3、glycosylatedpro

4、urokinasemutantconstruct

5、/YANGBo,LITian

6、de,WANGGuang

7、yi,CHENLian//ChineseJournalofCardiovascularRehabilitationMedicine,2007，16（2）:Abstract：Objective:Toconstructnon

8、glycosylated,thrombinKKME---专业医学搜索引擎http://www.kkme.net/resistantpro

9、urokinasemutantToexpresspro-UKgeneinCHO-dhfrcellsSerum

10、freeculturesu

11、pernatantwasharvestedToidentifytheactivityofpro-UKmutantMethods:WithPCRamplification,glycosylationsitewasdeletedbyAsn302-Ala302mutagenesisThrombincleavagesitewaseliminatedbyArg156-Lys156mutagenesisPro-UKgenewasintroducedintoDHFR-deficient(dihydrofolatereductase,DHFR)CHOcell

12、sSerum

13、freesupernatantwascollectedFibrinolyticagaroseplateassay(FAPA)wasusedtoidentifytheactivity.Results:DNAmolecularweightofPCRproductwasalittleabove1200daltonsasdeterminedbyagarosegelelectrophoresis,whichwasconsistentwiththeoreticalmolecularweight1296daltonsThesuccessfull

14、ytransfectedclonewasselectedforamplificationproductionThefibrinolyticactivityofsupernatantwas29558IU/mlbyFAPAConclusion:Non

15、glycosylated,thrombinresistantpro-UKmutantwasconstructedThecellsglowedwellaftertransfectionTheexpressioniscomparativelyhigh.Author′s　address：Departme

16、ntofCardiology,PLAGeneralHospital,Beijing,,ChinaKeywords：Urineplasminogenactivator;Thrombin;GlycosylationKKME---专业医学搜索引擎http://www.kkme.net/心肌梗塞、脑栓塞及其它血栓病是严重危害人类健康的常见病，我国每年至少有500万人需要溶栓治疗[1]，因此研制高效、特异、副作用小的新型溶栓制剂在心血管疾病的治疗中十分重要，溶栓是否有效，副作用是否最小，对患者的康复有直接影响。尿激酶原（pro-UK）具有选择性溶血栓作用，引起

17、了人们很大的兴趣。本研究构建了一种非糖基化、抗凝血酶激活的尿激酶原突变体，通过基因水平的改建，旨在提高尿激酶