阿米洛利对大鼠膀胱iccs细胞内ca2波动的影响研究

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1、常活动，提示膀胱有可能还受其它机制调控。这种情况下，膀胱的收缩更多的表现为肌源性特征，呈现出一定程度的非神经源性的自主性。以往的观点认为这种自发性兴奋起搏来源于逼尿肌细胞，但更多实验数据表明：逼尿肌细胞没冇自发性兴奋的特点，无法担当膀胱起搏的任务［3】。综合OAB的病因来看，多种因素参与致病。Kubota［4］等人研究发现：膀胱出口梗阻情况下，OAB膀胱中ICCs样细胞显著增多，提示OAB的发生可能和ICCs细胞增多；McCloskey［5］和Hashitani［6］等研究发现逼尿肌的自发性电活动源于逼尿肌束边缘的IC

2、Cs样细胞，这些细胞首先产生自发性电活动，随后刺激逼尿肌细胞产生动作电位，并通过肌间的缝隙连接传导，引起其他肌束的电位变化的收缩活动。分布在膀胱逼尿肌肌束间的膀胱ICCs细胞，可通过胞体间的缝隙连接及ICCs细胞的突起相互形成网状结构联系，并伸出突起到肌束内与平滑肌或神经组织相联系，缝隙连接是在相邻细胞间的缝隙中构成一个通道，细胞胞质中的离子和小分子物质可以通过这一通道相互沟通，进行细胞间通讯,使兴奋信号得到迅速传播［7】。原代培养的ICCs细胞和逼尿肌细胞的静息膜电位、膜电容存在明显差异；ICCs细胞可记录到起搏细胞

3、特征电流lh,而在逼尿肌细胞则记录不到［8］，同时膀胱ICCs细胞表面存在多种受体蛋白，最近有关超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolatization-activated，cyclicnucleotide-gatedcationchannel,HCN阳离子通道，简称HCN通道)在ICCs细胞膜上的发现为其是膀胱活动的潜在起搏点提供一重要依据［9】。由此可见ICCs对在膀胱逼尿肌异常收缩的病理过程中可能发挥重要作用。同时我们设想的一个问题是：有没冇一种药能够通过透过膀胱粘膜影响膀胱ICCs细胞从而抑制逼尿肌

4、异常收缩？本实验将在细胞水平进行实验探讨酸敏感离子通道抑制剂阿米洛利(Ami)对膀胱ICCs细胞内Ca24•浓度的影响，从而为通过阿米洛利影响膀胱ICCs为中间环节，间接影响膀胱逼尿肌收缩，为治疗膀胱异常收缩的相关疾病提供相关的基础研宄。材料和方法1、材料实验动物：健康成年SD大鼠，雌雄不限，体质量200〜250g。主要试剂:DMEM培养液、II型胶原酶（Sigma,美国）、胎牛血清（FBS,Hycone公司）、FicolWOO细胞分离液（Pharmacia，美国）、青链双抗（哈尔滨哈药集团，哈尔滨）、Alexa488

5、标记的兔抗羊焚光二抗、羊抗大鼠c-kit多克隆抗体（SantaCruz公司）、Fluo—3—AM（invitrogen公司）、盐酸阿米洛利（Sigma,美国）、胰蛋白酶抑制剂（Sigma，美国）、L-多聚赖氨酸（Sigma，美国）、干细胞生长因子（SCF，R&D公司）2、实验方法2.1体外膀胱ICCs的分离与培养2.1.1酶解液的配制：II型胶原酶10mg、牛血清白蛋白10mg、胰酶抑制剂10mg，放入小培养瓶中，加入D-Hank*s5ml,充分溶解，滤头过滤后备用。2.1.2标本的分离制备：动物采用SD大鼠2

6、-3月龄，体质量200-250g,提前沿下腹剪毛，断颈法处死动物，超净工作台内大鼠备皮处消毒后，在大鼠耻骨联合后方寻找辨认膀胱后取出膀胱，将膀胱组织放入冷D-Hank’s（PH7.0）液中漂洗数分钟，在解剖显微镜下纵行剪开膀胱，小心撕去膀胱粘膜和浆膜层后，制成细小肌条，并用D-Hank’s反复冲洗肌条3次。将膀胱肌条剪成l×l×lmm3组织块。2.1.3细胞悬液制作：将组织块移入培养瓶，加入配制好的酶解液充分混匀，37°C培养箱中消化15分钟，期间用吸管吹打2次，将消化好的组织悬液移

7、入离心管离心，1500rpm×5分钟，弃上清，去除消化酶；在离心管中加入等量D-Hank's，吹打混匀，组织悬液用200S细胞筛网过滤，去除组织碎块;将细胞悬液加进等体积的密度梯度分离液ACOII400,1000r/min离心7min,弃上清。2.1.4接种：将分离好的细胞悬液加入适当的DMEM培养基（含DMEM成分、10%FBS、lmlAntibiotic、SCF50ng/ml）,取0.1ml的细胞液滴到血细胞计数板，计算细胞密度将细胞浓度调整至l×106/ml并接种至6孔培养板，板中预先放置

8、包被贴黏多聚赖氨酸的盖玻片。放入培养箱内，在37°C,5%CO2条件下培养。培养24h后换液，去除未贴壁细胞，加入培养基继续培养，以后每隔Id换液一次，期间用倒置显微镜下观察细胞生长情况。2.2膀胱ICCs细胞的鉴定细胞稳定爬片培养5d后，进行免疫荧光检测。步骤：倾去培养基，用O.Olmol/PBS漂洗，5min×3次