DB22T 1608-2012 牛病毒性腹泻粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法

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1、ICS65.020.30B41备案号：35742-2013DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—2012牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法本标准仅供内部使用不得翻印Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofBovineviraldiarrhea/mucosaldisease2012-12-01发布2013-01-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—2012本标准仅供内部使用不得翻印前言

2、本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局技术中心。本标准主要起草人：孟庆峰、王伟利、吴连鹏、王玮琳、肖成蕊、蔡阳、宋战昀、孟日增。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—2012本标准仅供内部使用不得翻印牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（bovineviraldiarrhea/mucosaldisease，BVDV）荧光RT-PCR检测方法

3、。本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。本标准仅供内部使用不得翻印Ct值：达到阈值的循环数（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（Ribonucleic

4、Acid）荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5'端非编码区最保守的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的

5、基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂1DB22/T1608—20125.1.1水：配制方法见附录A.1。5.1.2Catrimox-14(Cat-14)。5.1.

6、3酚。本标准仅供内部使用不得翻印5.1.4三氯甲烷。5.1.5柠檬酸钠。5.1.6正丁醇。5.1.7乙酸钠。5.1.8乙醇。5.1.9异丙醇（-20℃预冷）。5.1.10其他试剂：AMV反转录酶(5U/μL)、RnaseInhibitor(40U/μL)、10×AMVRTPCRbuffer、MgCL2(25mM)、dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。5.1.11引物：根据病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）国际标准株基因序列设计合成一对特异性引物：上游引物5'-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3'

7、，下游引物5'-AACCACTGACGACTACCCTGTACT-3'，TaqMan探针（FAM）5'-CCATCCAACGAACTCACCACTGTTGC-3'（TAMRA）均配制成20umol/L，-20℃保存。5.2对照样品的制备5.2.1阳性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将牛病毒性腹泻粘膜病国际标准毒株按10%接种原代牛睾丸细胞，于37℃吸附1h后加入维持液（见附录A.2），37℃培养，待CPE达到70%时收获病毒悬液，冻融2次～3次，5000r/min离心10min，取上清液备用。5.2.2阴性对照样品由指定单位提供或下列方

8、法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融2次-3次，本标准仅供内部使用不得翻印5000r/min离心10min，取上清液备用。6仪器6.1荧光PCR检测仪。6.2高速