口蹄疫病毒hankou_99株基因组全序列测定与基因特征分析

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1、·７４·生物技术中国畜牧兽医２０１４年第４１卷第１２期口蹄疫病毒Ｈａｎｋｏｕ／９９株基因组全序列测定与基因特征分析曾江勇（西藏农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨８５０００９）摘要：本研究主要对口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）Ｈａｎｋｏｕ／９９株全基因序列进行测定，通过基因序列分析，确定其基因型，丰富了ＦＭＤＶ基因库，为研究猪源ＦＭＤＶ的分子变异、感染性分子克隆及致病机理奠定基础。从感染ＦＭＤＶＨａｎｋｏｕ／９９株的细胞液中提取ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ技术，获得猪ＦＭＤＶＨａｎｋｏｕ／９９分离株覆盖全基因组的５个ｃＤＮＡ片段（Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｄ、Ｅ），分别对这些片段进行

2、克隆和序列测定。结果显示，ＦＭＤＶＨａｎｋｏｕ／９９株全基因组长８０９９ｂｐ；５′ＮＣＲ长１０４０ｂｐ，开放阅读框长６９６６ｂｐ；３′ＮＣＲ长９３ｂｐ，其后是３０个碱基的连续ｐｏｌｙ（Ａ）结构。通过与参考株基因组结构比较分析，显示其在分类地位上属于Ｏ型ＦＭＤＶ，并与猪源ＦＭＤＶ毒株ＯＬＺ、ＴＷ／９７同源性较高，特别是３Ａ区域上都有３０ｂｐ的缺失。另外，通过与９个参考株的ＶＰ１系统发生树分析，显示其与ＯＬＺ、ＴＷ／９７、Ｏ／Ａｋｅｓｕ／５８、Ｏ／ＯＭⅢ４个毒株为同一基因型。关键词：口蹄疫病毒；Ｈａｎｋｏｕ／９９株；全基因组；序列测定；ＶＰ１中图分类号：Ｓ８

3、５２．６５文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－７２３６（２０１４）１２－００７４－０７口蹄疫（ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ，ＦＭＤ）是由口Ｊａｃｋｓｏｎ等，２００３）。Ｏ型ＦＭＤＶ是世界范围内广泛蹄疫病毒（ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＦＭＤＶ）引起流行的一种，中国也以该型流行为主（胡文发等，的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，２０１３），Ｏ型ＦＭＤＶ有不同毒株系，如云南６１系、泛早在１９７４年就被国际兽医局（ＯＩＥ）列为Ａ类兽疫亚系、新疆５８系（Ａｋｅｓｕ）等。以前科学工作者们对病之首（何洪彬，２０１１）。

4、目前，约有２／３的ＯＩＥ成ＦＭＤＶ的研究主要是针对牛和羊，对猪的ＦＭＤＶ员国报告存在ＦＭＤ疫病的流行，这些疫情时刻威研究很少，自台湾１９９７年暴发猪ＦＭＤ以来（Ｂｅａｒｄ胁着无ＦＭＤ国家和地区的家畜安全和畜产品贸等，２０００），人们已越来越重视对猪源ＦＭＤＶ的研易，该病暴发会对流行该病的国家或地区产生巨大究。为了从分子生物学和分子遗传学角度深层研究的政治、经济影响，在中国，该病已被列为重大动物牛源和猪源ＦＭＤＶ的差异，本试验开展了对１株猪疫病之首（张元沛等，２０１３）。ＦＭＤ病原属小ＲＮＡ源ＦＭＤＶ基因序列的测定，通过基因特性的分析，病毒科口蹄疫病毒属，

5、目前已知有７个血清型（Ａ初步确定了其基因型，这为ＦＭＤＶ的研究提供了更型、Ｏ型、Ｃ型、亚洲１型、ＳＡＴ１型、ＳＡＴ２型和多有用的信息。ＳＡＴ３型），每个血清型又有很多亚型。完整的ＦＭ－１材料与方法ＤＶ颗粒包括衣壳和ＲＮＡ２部分，基因组为单股正１．１试验毒株ＦＭＤＶＨａｎｋｏｕ／９９株由中国农业链ＲＮＡ，约有８５００个核苷酸，５′端连接一种特殊的科学院兰州兽医研究所病毒病研究室保存并提供。小蛋白ＶＰｇ（Ｋｉｎｇ等，１９８０），紧接着是约１３００ｂｐ１．２感受态细胞、载体和主要试剂大肠杆菌的５′非编码区（ＮＣＲ），３′端有ｐｏｌｙ（Ａ），其上游是约ＤＨ５α和

6、ＪＭ１０９感受态细胞；ｐＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ、９０ｂｐ的３′非编码区，基因组的中部是一个大的开ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ试剂盒均购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｅｘ放阅读框（ＯＲＦ），编码一多聚蛋白，多聚蛋白在翻Ｔａｑ酶、ＬＡＴａｑ酶、ＡＭＶ反转录酶、ＤＮＡＭａｒｋ－译的同时，经二级裂解后形成３～４种病毒结构蛋白ｅｒ、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）（ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１）和８种非结构蛋白（Ｌ、２Ａ、有限公司；ＲＮＡｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ购自Ｑｉａｇｅｎ公司；Ｂ２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ和３Ｄ）（Ｇｒｕｂｍａｎ等，１９８４；型质粒小量快速提

7、取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。收稿日期：２０１４－０７－３０１．３引物设计与合成使用ＤＮＡＳｔａｒ软件，根据作者简介：曾江勇（１９７３－），男，湖南人，博士生，副研究员，研参考毒株ＦＭＤＶＣｈｉｎａ／９９的基因序列，分别设计究方向：预防兽医与流行病学。基金项目：牦牛品种改良与高效养殖技术集成（２０１２ＢＡＤ－了涵盖ＦＭＤＶＨａｎｋｏｕ／９９株基因组序列的５对引０３ＢＯ２）。物（表１），其中Ｓ片段的上游引物５′端引入Ｔ７启动中国畜牧兽医２０１４年第４１卷第１２期生物技术·７５·子核心序列。扩增片段从５′端至３′端分别命名为Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｄ

8、和Ｅ。表１用于扩增ＦＤＭＶＨａｎｋｏｕ／９９株全长ｃＤＮＡ的引物引物名称引物序列