优良枯草芽胞杆菌的筛选及对小鼠安全性评价

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1、动物医学进展，２０１４，３５（１２）：４１－４４ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ优良枯草芽胞杆菌的筛选及对小鼠安全性评价王苇，秦瑶，周霞＊，屈勇刚，王礼伟，郭秉娇，王熙楚，李劼，王晓兰（石河子大学动物科技学院，新疆石河子８３２００３）摘要：为进一步鉴定、分析和评价分离于鸡粪便的１３株芽胞杆菌，根据枯草芽胞杆菌１６ＳｒＲＮＡ序列设计特异性引物，ＰＣＲ扩增１３株分离于鸡粪便的芽胞杆菌，将扩增片段测序并分析同源性；将鉴定的枯草芽胞杆菌进行耐酸、耐胆盐、耐高温等试验，同时用不同剂量

2、菌液分别以不同方式感染小鼠，定期称重、观察各脏器病理变化和计算主要脏器系数。结果显示，Ｑ０４、Ｑ０５、Ｑ０９与ＧｅｎＢａｎｋ公布的枯草芽胞杆菌１６ＳｒＲＮＡ序列同源性为９９％，且Ｑ０４在ｐＨ２．５，胆盐浓度２ｇ／Ｌ以及１００℃时生长良好；感染小鼠全部健康存活，体重均有增加；小鼠脏器无病变，脏器系数无显著差异（Ｐ＞０．０５）。由结果可知，分离鉴定菌株Ｑ０４、Ｑ０５、Ｑ０９为枯草芽胞杆菌，其中Ｑ０４具有更好的生物学特性，并且对小鼠安全无毒，可作为微生态制剂的候选菌株。关键词：枯草芽胞杆菌；１６ＳｒＲＮ

3、Ａ；安全性评价中图分类号：Ｓ８５２．６１６文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１４）１２－００４１－０４益生菌是通过定植作用改变宿主某一部位菌群明、特治星、甲氧苄啶、氟苯尼考均购自杭州微生物组成、从而产生有利于宿主健康作用的单一或组成试剂有限公司；ＬＢ固体培养基和液体培养基：按实明确的混和微生物，目前广泛应用于食品发酵、医疗验室常规方法配制。［１－４］保健和畜牧业生产领域。我国允许作为生态制１．１．３实验动物健康小鼠，体重３３ｇ±３ｇ，由石剂的微生物有乳酸菌、粪肠球菌、芽胞杆菌和酵母菌

4、河子大学实验动物中心提供。等。枯草芽胞杆菌作为一种主要的益生菌，以其具１．２方法有生物夺氧、拮抗致病微生物，改善体内外生态环１．２．１提取细菌ＤＮＡ模板参照文献［６］进行。境、增强动物体的免疫功能、产生多种消化酶、产生１．２．２１６ＳｒＲＮＡＰＣＲ扩增与测序应用Ｐｒｅｍｉ－［５］多种营养物质的作用，已成为目前饲料添加剂中ｅｒ５．０软件设计上、下游引物ｋ１与ｋ２。ｋ１：５－ＧＣＧ－最富有活力的产品。ＧＣＴＴＣＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＡＴ－３，ｋ２：５－ＣＴＴＣＧＣ－枯草芽胞杆菌应用于动物生产时，优良菌

5、株的ＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＣＣ－３，目的片段长为４３９ｂｐ，筛选以及菌株的安全性是关键。为此，本研究基于由北大华大基因工程有限公司合成。ＰＣＲ产物交１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析进一步确定分离于鸡粪便由北大华大基因工程有限公司测序。的１３株枯草芽胞杆菌，通过一系列手段筛选性状优１．２．３序列比较分析测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ数据良的枯草芽胞杆菌，同时进行生物安全性评价，为后库中进行１６ＳｒＲＮＡ序列比对分析，同源性大于期的开发应用提供有用数据。９９％的细菌判定为同种细菌；同源性介于９５％～１材料与方

6、法９９％判定为同属；同源性在９１％～９５％判定为同［７］１．１材料科。最终应用ＤＮＡＳｔａｒ软件对ＰＣＲ产物测序结１．１．１菌株疑似枯草芽胞杆菌１３株，分离于石果进行同源性分析。河子大学动物科技学院试验站饲养的杂交肉鸡粪１．２．４菌株生物学特性测定菌株耐酸能力测定、便，并通过形态学和生化试验进行了初步鉴定。菌株耐胆汁盐能力测定、菌株耐高温能力测定均参１．１．２试剂抗菌药物纸片：哌拉西林、阿米卡星、照文献［８－９］进行；采用常规Ｋ－Ｂ法选择常用的１０四环素、诺氟沙星、氨曲南、多黏菌素Ｂ、复方新诺种抗

7、菌药物对菌株进行抗菌药物敏感性测定。收稿日期：２０１４－０４－０１基金项目：石河子大学重大科技攻关项目（ｇｘｊｓ２０１１－ｚｄｇｇ０１－０４）；国家自然科学基金项目（３１１６０５０７）；新疆生产建设兵团重点领域科技攻关项目（２０１３ＡＢ００４）作者简介：王苇（１９８７－），男，陕西汉中人，硕士研究生，主要从事兽医微生物研究。＊通讯作者４２动物医学进展２０１４年第３５卷第１２期（总第２５８期）１．２．５分离株的安全性评价小鼠随机分成Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２共４个组，每组１０只。Ａ１组腹腔注射９０．３ｍ

8、Ｌ菌液（活菌数量为１．６×１０ＣＦＵ／ｍＬ），Ａ２组腹腔注射相同剂量灭菌ＬＢ肉汤作为对照；Ｂ１组口服０．４ｍＬ菌液（活菌数量为１．６×１０９ＣＦＵ／ｍＬ），Ｂ２组口腔灌服灭菌的ＬＢ肉汤０．４ｍＬ作为对照，连喂３ｄ。７ｄ后，定期观察小鼠精神状况、食欲、活动、粪便等。最后称重并处死小鼠，取出脏器，并称［１０］量，求脏器系数，观察各脏器病理变化。脏器系数＝实验动物某脏器的重量／动物体重Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ１２００；１～１０．分离的枯草芽胞杆菌小鼠试验前后体重、小鼠增重以及各内脏脏器Ｍ．ＤＮ