高效生防菌枯草芽胞杆菌的筛选与其发酵工艺优化

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1、华中农业大学2008年硕十生毕业论文摘要在农业生产过程中，植物病原真菌和细菌很易感染植物，每年造成巨大的经济损失。化学农药曾经在植病防治上发挥了巨大的作用，但是它引起土壤、水体和大气的污染，农副产品中农药残留增加，直接危害了人类的健康及生存，以及病原菌的抗药性等问题，由此加速了人们去寻求新的安全有效的植物病害防治途径，生物防治便是其中一种有效的防治途径。本研究以西瓜枯萎尖镰胞菌(Fusariumoxysporumfsp．melonis)为指示菌，通过NA平板初筛，从实验室保存的482株细菌中得到了17株可以抑制西瓜枯萎尖镰胞菌生长的拮抗菌株，抑菌带宽度达到8．5"26mm。经

2、过多次传代，保留10株抑菌圈带宽度稳定在10rnlTl以上的拮抗菌株。同时测得其中BS．3、BS．5、BS．17等菌株对多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用。温室盆栽实验表明，BS．3、BS．5、BS．17对西瓜枯萎病的防病效果分别为25．70％、81．77％和41．27％。在湖北省农科院的大田试验重复测定BS．5对西瓜枯萎病的防病效果，发现其防病效果达到了84．58％。由此可见，BS．5对于防治西瓜枯萎病具有良好的效果，有作为生防制剂的潜力。通过形态和生理生化特征初步鉴定菌株BS．5为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，16SrDNA序列分析进一步确定该菌株为

3、枯草芽胞杆菌。通过硫酸铵分级盐析法对BS．5所产拮抗物质进行了初步提取，发现当硫酸铵饱和度在40％以下时，沉淀物基本无拮抗活性；硫酸铵饱和度在40％"-80％之间，基本可以将拮抗物质完全沉淀。在此基础上，初步研究了拮抗粗提物的理化性质。实验结果表明，BS．5拮抗粗提物经100℃处理20min之后的活性可保存70％以上，121℃处理20min后的抑菌活性明显下降到35．92％；将拮抗粗提物经氯仿、无水乙醇、乙腈等有机溶剂处理后其抑菌活性基本保持不变；而经紫外线、蛋白酶和高离子强度处理后抑菌活性保持80％以上；在pH5"-8之间活性稳定；BS．5拮抗物质的茚三酮反应呈阴性，酸水解

4、后茚三酮反应呈阳性，双缩脲反应也呈阳性。以金氏培养基为出发培养基，通过摇瓶发酵优化试验，得到BS．5生长的培养基组成和培养条件为：葡萄糖60∥L，豆粕20g／L，酵母粉3∥L，K2HP04"3H20l∥L，MgS04·7H200．2g／L；培养温度30℃，种龄8h，接种量2％，在500mL摇瓶中装液量为30mL，初始pH7．5，最终生物量达到6．2×109cfu／mL。在3L发酵罐中进行BS．5发酵工艺优化，将豆粕浓度提高到40g／L，此时生物量可以达到8．2x109cfu／mL；在补糖发酵试验中，初始糖浓度为20∥L，当葡萄糖浓度低于10g／L时，补加葡萄糖(每次补加量为2

5、0g／L，共补加两次)，生物量提高到2．8x1010cfu／mL。关键词：枯草芽胞杆菌；筛选；拮抗；培养基；优化；生物量；补料发酵华中农业大学2008年硕士生毕业论文AbstractInproductionagriculture，Fungalandbacterialplantpathogensinfectplantsandcropseasilyandoftenseriously,causinggreateconomicdamageApplicationofchemicalpesticidesistheeffectivemeasuretocontrolthefungalandb

6、acterialinfectionandplaysanimportantroleinpreventivedefence．Withthefurtherknowledgetochemicalpesticides，however,theybringaboutpollutionofsoil，waterandatmosphere，andimperilshumanhealthandlifedirectly,ecologicalenvironment．So，newandsafealternativecontrolmeasuresaremuchsoughtafter．Biologicalco

7、ntrolbynaturalantagonisticorganismsisapotentialnonchemicaltoolforcropprotectionagainstphytopathogenicfungiandbacteriaandoffersapromisingalternativetosyntheticpesticides．Inourstudy,withFusariumoxysporumfsp．melonisasthetestedstrains，17antagonisticstrainswe