一种高通量快速鉴定重组子方法的建立

《一种高通量快速鉴定重组子方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、江苏农业科学2014年第42卷第5期—65—王亚男，黄培华，樊宝良．一种高通量快速鉴定重组子方法的建立［J］．江苏农业科学，2014，42(5):65－66．一种高通量快速鉴定重组子方法的建立131，2王亚男，黄培华，樊宝良(1．河北农业大学动物科技学院，河北保定071000;2．河北工程大学农学院，河北邯郸056038;3．河北工程大学教育技术中心，河北邯郸056038)摘要:利用添加了ＲNaseA的1Xcrackingbuffer直接裂解细菌增强观测效果，排除ＲNA干扰，通过琼脂糖凝胶电泳与空载体质粒进行比较，建立一种高通量快速鉴定重组子的方

2、法。该方法方便易行，大大提高了工作效率。关键词:crackingbuffer;直接裂解;ＲNAseA;重组子鉴定;克隆鉴定;优化方法中图分类号:Q784文献标志码:A文章编号:1002－1302(2014)05－0065－02在分子生物学研究中，筛选阳性重组质粒DNA是非常重法，从传统的碱裂解质粒DNA的原理出发，逐步建立了一种要的步骤之一，由于受连接效率、转化效率等多种因素的制更为简捷快速且成本低廉的重组子鉴定方法。约，筛选阳性重组子成为一项十分繁琐复杂的工作。蓝白斑1材料与方法筛选(LacZ的a互补)通过颜色反应区分阴阳性克隆，出现［1］假阳

3、性概率较高;PCＲ法鉴定重组克隆需事先设计相应引1．1材料［2］物，限制性内切酶酶切鉴定法需提取质粒DNA，反应所需1．1．1质粒和菌株大肠埃希菌JM109和T－simple载体材料成本较高，需要时间长。近几年人们建立了一些快速鉴以及转化平板由笔者所在实验室保存提供。克隆片段为定重组质粒的方法，但有的需要使用苯酚/氯仿/异戊醇(体560bp的猪2型圆环病毒核衣壳蛋白基因部分片段，由笔者［3］积比25∶24∶1)等毒性较高的材料，有的裂解缓冲液成分所在实验室扩增得到。［4－5］［6］复杂，有的需要昂贵的试剂盒，而利用1%SDS一步裂1．1．2试剂1

4、Xcrackingbuffer(1．0mol/LNaOH，0．5mol/L［7］解法获取质粒DNA的方法则需要较长的摇菌或培养转化EDTA，1%SDS)为自行配置，ＲNAseA(10mg/mL)，氨苄青霉平板的时间。笔者在科研实践中不断地总结了很多筛选方素(100mg/mL)。Tris碱、EDTA和冰乙酸等试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。收稿日期:2013－09－181．1．3培养基LB液体培养基:10g胰蛋白胨，5g酵母提基金项目:国家转基因重大专项(编号:2013ZX08006－005)。作者简介:王亚男(1987—)，女，河北承德

5、人，硕士研究生，主要从事取物，10gNaCl，1000mL蒸馏水，高压灭菌。LB固体培养动物遗传育种与繁殖方面的研究。E－mail:sxdc1987@sina．cn。基:15g琼脂糖，1000mLLB液体培养基，高压灭菌(配制培通信作者:樊宝良。E－mail:fanbl119@sina．vip．com。养基所用制剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄yellowsdiseaseandtheirrelationshipwithpotex－andcarla

6、viruses［8］杨洪一．草莓病毒分子检测及其部分基因组序列分析［D］．沈［J］．JournalofGeneralVirology，1994，75(7):1535－1542．阳:沈阳农业大学，2005．［2］KunduJK．TheapplicationofＲT－PCＲassayforthedetectionof［9］Kaden－KreuzigerD，LamprechtS，MartinＲＲ，etal．Immunocaptureapplestempittingvirusandapplestemgroovingvirusinfourapplepoly

7、merasechainreactionassayandELISAforthedetectionofstraw-cultivars［J］．PlantProtectionScience，2002，38(1):13－17．berrymildyellowedgeassociatedpotexvirus［J］．ActaHort，1998［3］刘福昌，王焕玉．苹果潜隐病毒(Latentvirus)研究Ⅱ．苹果品(385):33－40．种和矮生砧木潜隐病毒鉴定［J］．植物病理学报，1989，19(4):［10］王国平，洪霓，张尊平，等．我国北方梨产区主栽品种病

8、毒种193－197．类的鉴定研究［J］．中国果树，1994(2):1－4．［4］侯义龙．果树主要病毒ＲT－PCＲ检测体系的建立、优化及病