一种磷脂酶a2抑制剂体外高通量筛选方法的建立

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1、一种磷脂酶A2抑制剂体外高通量筛选方法的建立朱京童郑智慧路新华范玉玲张华贺建功（华北制药集团新药研究开发中心，微生物药物国家工程研究中心石家庄050015）摘要：目的：磷脂酶A2(PLA2)是一个重要的抗炎和心血管疾病药物靶点，本研究拟建立一种荧光的磷脂酶A2(PLA2)抑制剂体外高通量药物筛选方法。方法：以7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate为荧光底物，水解产物在355ex/460em下有特定荧光，间接反映酶活性。利用96孔板，通过对酶浓度、反应时间等多个条件的优化，摸索最佳的反

2、应条件。利用阳性药二乙烯三胺五乙酸进行模型验证。结果：在酶浓度2.25U/ml、底物浓度30μM和反应时间30min时，为最适反应条件。阳性药在该模型上表现出好的浓度剂量依赖抑制效果，IC50为0.37µmol/L。利用该模型，本研究从微生物次生代谢产物筛选得到两个活性化合物F02ZA-2396A、F02ZA-2396B，其IC50分别为152μM和72μM。结论：本研究建立了一个高通量的磷脂酶A2抑制剂体外药物筛选方法，该方法灵敏、快捷、可操作强，可用于各种来源的化合物的快速活性筛选。关键词：磷脂酶A2；抑

3、制剂；体外；荧光法Afluorescence-basedmethodonthehighthroughputscreeningassayforPLA2inhibitorinvitroZhuJing-tong,ZhengZhi-hui,LuXin-hua,FanYu-ling,ZhangHua,HeJian-gong(NewDrugsResearch&DevelopmentCenterofNorthChinaPharmaceuticalGroupCorporation,NationalMicrobialMedic

4、ineEngineering&ResearchCenter,Shijiazhuang050015)ABSTRACT:OBJECTIVE:Toestablishafluorescence-basedmethodinvitroforhighthroughputscreeningphosphplipaseA2(PLA2)inhibitor.METHODS:using7-Hydroxycoumarinyl-arachidonateasafluorescentsubstrate，todeterminetheactivi

5、tyofphosphplipaseA2bymeasuringthe355ex/460emfluorescencevaluein96-wellmicroplates,TheeffectofpositivedrugsandsamplesonphosphplipaseA2activitywereevaluated.RESULTS:With2.25U/mlconcentrationoftheenzyme,30μMconcentrationofthesubstrateand30minreactiontime,there

6、isadose-dependentmannerbetweenthem..Positivecontrol,DTPAshowedgoodinhibitoryactivityindose-dependentmannerwithIC50of0.37µmol/L,Inthecourseof8screeningforPLA2inhibitorsfrommetabolitesofmicroorganisms,twocompoundsnamedF02ZA-2396AandF02ZA-2396Bwereconformedast

7、hePLA2inhibitors,theirIC50valueare152μmol/land72μmol/l，respectively.CONCLUSION:Themethodissensive,rapid,accuratevalidforscreeningthePLA2inhibitorsinvitro.KEYWORDS:phosphplipaseA2;inhibitor;invitro;fluorescence作者简介：朱京童，（1977年出生），女，硕士在读，工程师。研究方向：药物筛选基金资助：国家科技

8、部创新药物筛选技术平台研究资助项目，项目编号：2002AA2AZ343D通信地址：E-mail:zhujingtong2003@yahoo.com.cn磷脂酶A2(phospholipaseA2PLA2)是一种重要的代谢和调节酶类，已有150个以上的氨基酸序列可在蛋白质序列库中找到[1]。在生物界中分布广泛，大量存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒，动物胰脏及植物组织中[2]。所有的PLA2都有一种最基本的作用，