重组子的鉴定

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1、2011/5/26一、实验目的重组子的鉴定通过本实验掌握重组DNA鉴定的原理和方法。二、实验原理基因导入方法基因导入方法::1.重组DNA导入细胞的方法1)电击法电击法(Gene(Gene2.重组DNA的鉴定方法transferbyelectropp)oration)基因枪注射法基因导入方法基因导入方法::2)2)基因枪法基因枪法(Biolistic(Biolistic--bombardment)(bombardment)(植物细胞植物细胞))ClarkandRussell,200012011/5/26（3）脂质体法2.重组子的鉴定（lipofectio

2、n）将待转染的DNA溶显色筛选法液与磷脂混合，后者在表面活性剂存在下显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也形成包埋水相DNA可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子的脂质体结构。当这种脂质体悬液加入到上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产细胞培养液中，便会生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉进入细胞质或细胞核菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等内。图3.质脂体介导的基因转移载体遗传标记检测重组质粒转化宿主细胞后，显色筛选法还需对转化菌落进行筛选鉴

3、定。利用α互补现象进显色筛选法的基本操作：行筛选是最常用的一种鉴lacZ'定方法将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基oripUC18α互补：质粒载体上lacZ’因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、基因编码的α肽段与失去rAplacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现lacZ+，蓝色菌落互补的现象Ap+X-gal由α互补而形成的有功能重组子（Apr+lacZ-）活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal显色测定出来E.coliDH5α互补的插入失活pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点受体菌基因

4、组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。不能分解Xgal。pUC质粒载体上的lacZ’编码肽与这个缺失突5’MCSlacZ’3’5’外源DNAlacZ’3’变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，又能分解Xgal。产生蓝色物质。肽肽移码突变互补不互补22011/5/26Alfa互补α互补的检测IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。外源基因插入与否可通过载体上的LacZ基因进行

5、初步的筛选。有外源基因插入的细菌呈白斑，无外源基因插入的细菌呈蓝斑。任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。32011/5/26克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本

6、也高。克隆DNA序列检克隆DNA序列检测限制性酶切图谱测1.00.8限制性酶切图谱法1.00.8法全酶解图谱法：BBBkbEEPPkbB全酶解图谱法：SSSkbBBPPkbS区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子4.04.0用BamHI酶切转化子质粒DNA如果外源DNA片段插在pUC18kbkb电泳观察酶解产物片HindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnI的SphI位点处，原则上也可用HindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIHindIIISphIPst

7、ISalIBamHISmaIKpnIEcoRIEcoRI段重组子：2.7kb+4.0kbSphI酶解鉴定，但这样做很不lacZ’lacZ’非重组子：2.7kb经济，因为SphI非常昂贵（每如果外源DNA片段也是2.7kb，pUC1100单位50美元）。用HindIII和pUC1最好选用单一切口的酶将质粒线82.7oriEcoRI联合酶解同样可以达到目82.7ori型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重Aprkb的，但这两种酶的价格只及AprkbSphI的1/50组子42011/5/26克隆DNA序列检克隆DNA序列检测限制性酶切图谱测1.00.8限制性酶切图谱法

8、2.02.0法全酶解图谱法：BBBkb