2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究

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1、2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究：柴可夫黄晓玲钱俊文马纲【摘要】目的］从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。［方法］抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分离血液中的白细胞，提取总RNA，化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArrayAnalyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和I):BMI=体重（kg）/身高（m2）。　　2.2生化检测所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml，用于测空腹血糖、血脂、

2、糖化血红蛋白（HbAlc）、胰岛素抵抗指数（ISI=ln［1/(FBS×FINS)］）、血钙、血钾等生化检测。　　2.3基因芯片检测　　2.3.1白细胞的提取与RNA的纯化随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml，用红细胞裂解液分离白细胞，采用Trizol一步法抽提总RNA，用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度，A260/A280比值在1.8～2.1为较纯的RNA，可用于芯片检测。　　2.3.2芯片杂交经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进

3、行化学发光检测的AmpoLabelingLPR标记，变性的cDNA探针全部加入0.75ml预热的GEAprehyb中，混匀，放在60°C待用。弃去杂交管中的GEAprehyb溶液，加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中，60°C下6rpm杂交。　　2.3.3化学发光检测洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶（AP），再洗膜4次，加入CDPStar化学发光底物至杂交管中，室温孵育2min。用滤纸去除多余的CDPStar溶液，用X射线胶片曝光。　　2.3.4图像采集和数据分析运行ScanAlyze

4、软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，使用芯片配套软件GEArrayAnalyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。　　2.4逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法验证部分差异表达基因。　　2.4.1引物设计将RNA反转录合成CDNA，用Primer5软件设计，由上海生物工程技术有限公司合成。　　扩增引物PrimerbpIRS2FOXC2βactin上游5'TTGAGGCGGCTAAGTCT3'下游5'TCCCAGgATgCTgTTgC3'上游5'CCTTCTA

5、CCgCGAGAACAAG3'下游5'CCGgGTCGAgCGTCCAGTAG3'上游5'ATGCCATCCTGCgTCTG3'下游5'ACTCCTgCTTGCTGATCC3'393520566　　2.4.2扩增反应条件：　　FOXC294℃5min；94℃30s；60.0℃50s；72℃1min；72℃5min；共30个循环　　IRS294℃5min；94℃30s；55.5℃50s；72℃1min；72℃5min；共30个循环　　βactin94℃5min；94℃30s；55.

6、5℃50s；72℃1min；72℃5min；共30个循环　　扩增产物取10μl的βactin和10μl目的基因在1.2%琼脂糖(含EB0.5ng/ml)上电泳，紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，结果为基因表达量对βactin内参的比值，以上结果重复3次，取平均值。　　2.5化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5min。去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图

7、片上每个特异条带灰度值数字化。　　2.6统计学分析各组实验数据以(x±s)表示，采用SPSSWindows13.0软件处理，以OneWayANOVA方法进行方差分析，P<0.05为统计学意义显著性标准。　　表1糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、HbAlc、ISI的比较（略）　　与健康组比较,*P<0.05,#P<0.01　　表2糖尿病湿热困脾证与健康对照组TG、HDLC、LDLC的比较（略）　　与健康组比较，*P<0.01　　表3糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、H

8、bAlc、ISI的比较（略）　　与健康组比较，*P<0.01　　3.2基因芯片检测结果　　3.2.1总RNA提取结果总RNA紫外分光OD26/OD28在1.8～2.0之间，提取的总RNA28S、18SrRNA亮而浓条带清晰，RNA样品电泳条带清晰，28S比18S条带的亮度接近2∶1，质量符合分类表达谱芯片实验要求，总RNA质量完整无降解。　　3.2.2湿热困脾证糖尿病患者的基因表达研究　湿热困脾证糖尿病患者与健康对照组相比，共筛选出表达量改变比值大于2倍的基因38条，其中表达