药学毕业论文2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究

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1、XX大学毕业论文2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究2014年6月25日2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究作者：柴可夫黄晓玲钱俊文马纲【摘要】目的］从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。［方法］抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分离血液中的白细胞，提取总RNA,化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArrayAnalyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和Westernblotting方法验证。［结杲］2型糖尿病湿热困脾证患者血糖，血脂,屯解质与健康人有显著差异，基

2、因芯片检测发现和健康人差异表达基因共38条,其屮上调的基因有24条，下调的基因有14条。并发现湿热困脾证的特异性基因。通过RTPCR和Westernblotting方法反向验证IRS2和F0XC2基因，证实2型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细胞屮存在IRS2和FOXC2存在差异表达。［结论］应用基因芯片筛选2型糖丿求病湿热困脾证的差异表达基因，为2型糖乐病辨证论治提供新思路。【关键词】2型糖尿病;基因芯片;辨证分型糖尿病是一组由遗传和坏境因素相互作用而引起的慢性疾病。因唳岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛索敏感性降低，引起糖、蛋白质、脂肪、水

3、和电解质等一系列代谢紊乱为主要共同标志。木研究观察糖尿病湿热困脾证的基因表达差异，探讨2型糖尿病湿热困脾证的证候实质。1临床资料1.1研究对象对浙江屮医药大学附屈第二医院糖尿病防治屮心400例糖尿病患者进行中医辨证分型，随机选取6例湿热困脾证患者，其中男性3例，女性3例，年龄30岁至65岁之间，年龄(57.6±7.7)岁。另选取年龄与性别相匹配的健康人6例作对照，平均为(50.8±9.4)岁。健康对照组皆通过血糖检查排除糖尿病，通过病史调查和休检、血彖、肝肾功能、胸透、心电图等检查，排除其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。1.2现代医学诊断标准根据19

4、99年WHO专家咨询报告诊断标准，空腹血糖(FPG)>7.0mmol/L(126mg/dl)；或糖耐量试验(OGTT)中服糖后2小时血糖(2HPG)ol/L(200mg/dl)；或随机血糖211」mmol/L(200mg/dl)。1.3屮医辨证标准参照2002年版《屮药新药临床研究指导原则(试行)》中“中药新谿治疗糖床病的临床研究指导原则”，湿热困脾证,主症：胸胶腹胀，或食后饱满，头身困重。次症：体形肥胖，心胸烦躁，四肢倦怠，小便黄赤，大便不爽。舌脉：舌红苔黃腻，脉滑而数。1.4病例纳入和排除原则凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准，可纳入试验病例。

5、排除①有糖尿病急性并发症；②经确诊为1型糖尿病，其它类型糖尿病及妊娠糖尿病者；③年龄在40岁以下或70岁以上，妊娠或哺乳期妇女；④有严重心、肝、肾等并发症，或合并有其它严重原发性疾病，精神病患者。⑤中医辨证症状不典型，或者两型三型并见证型复杂者。2实验方法2.1一般情况测量身高，体重。计算体重指数(BMI):BMI=体重(kg)/身高(m2)。2.2生化检测所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml,用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白(HbAlc)膜岛索抵抗指数(ISI=ln[l/(FBSxFINS)])、血钙、血钾等生化检测。2.3基因芯片

6、检测231H细胞的提取与RNA的纯化随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml,用红细胞裂解液分离白细胞，采用Trizol一步法抽提总RNA,用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度，A260/A280比值在1.8〜2.1为较纯的RNA,可用于芯片检测。2.3.2芯片杂交经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进行化学发光检测的AmpoLabelingLPR标记，变性的cDNA探针全部加入0.75ml预热的GEAprehyb屮，混匀，放在6（TC待用。弃去杂交管屮的GEAprehyb溶液,加入含探针的G

7、EAhyb混合液至杂交管中，60°Cb6rpm朵交。233化学发光检测洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸（AP）,再洗膜4次，加入CDPStar化学发光底物至杂交管中，室温孵育2mim用滤纸去除多余的CDPStai•溶液，用X射线胶片曝光。2.3.4图像采集和数据分析运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，使用芯片配套软件GEArrayAnalyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。2.4逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法验证部分差异表达基因。2.4.1引物设计将RNA反转录合成CDNA,用Primer5软件设

8、计，由上海生物工程技术有限公司合成。扩增引物PrimerbpIRS2FOXC2pactin上游亍TTGAGG