2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究论文

《2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究论文柴可夫黄晓玲钱俊文马纲【摘要】目的］从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。［方法］抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分离血液中的白细胞，提取总RNA，化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArrayAnalyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和I):BMI=体重（kg）/身高（m2）。2.2生化检测所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml，用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白（HbAlc）、胰岛素抵抗指数（ISI=ln［1/(FBS×FINS

2、)］）、血钙、血钾等生化检测。2.3基因芯片检测2.3.1白细胞的提取与RNA的纯化随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml，用红细胞裂解液分离白细胞，采用Trizol一步法抽提总RNA，用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度，A260/A280比值在1.8～2.1为较纯的RNA，可用于芯片检测。2.3.2芯片杂交经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进行化学发光检测的AmpoLabelingLPR标记，变性的cDNA探针全部加入0.75ml预热的GEAprehyb中，混匀，放在60°C待用。弃去杂交管中的GEApre

3、hyb溶液，加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中，60°C下6rpm杂交。2.3.3化学发光检测洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶（AP），再洗膜4次，加入CDPStar化学发光底物至杂交管中，室温孵育2min。用滤纸去除多余的CDPStar溶液，用X射线胶片曝光。2.3.4图像采集和数据分析运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，使用芯片配套软件GEArrayAnalyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。2.4逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法验证部分差异表达基因。2.4.1引物设计将RNA反转录合成CDNA，用Pr

4、imer5软件设计，由上海生物工程技术有限公司合成。扩增引物PrimerbpIRS2FOXC2βactin上游5'TTGAGGCGGCTAAGTCT3'下游5'TCCCAGgATgCTgTTgC3'上游5'CCTTCTACCgCGAGAACAAG3'下游5'CCGgGTCGAgCGTCCAGTAG3'上游5'ATGCCATCCTGCgTCTG3'下游5'ACTCCTgCTTGCTGATCC3'3935205662.4.2扩增反应条件：FOXC294℃5min；94℃30s；60.0℃50s；72℃1min；72℃5min；共30个循环IRS29

5、4℃5min；94℃30s；55.5℃50s；72℃1min；72℃5min；共30个循环βactin94℃5min；94℃30s；55.5℃50s；72℃1min；72℃5min；共30个循环扩增产物取10μl的βactin和10μl目的基因在1.2%琼脂糖(含EB0.5ng/ml)上电泳，紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，结果为基因表达量对βactin内参的比值，以上结果重复3次，取平均值。2.5化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5min。去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光

6、。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。2.6统计学分析各组实验数据以(x±s)表示，采用SPSSr180000)最初是从骨髓组织中提纯分离，称为4PS，因与IRS1有高度保守结构和一些共同功能，后定名为IRS2［5］。已证明IRS2的表达下降有助于2型糖尿病的形成。造成IRS2表达下降的原因包括基因启动子或增强子的突变，这使转录速度减小；还包括造成mRNA稳定性或转录效率下降的突变等。本项研究中发现有5条特异性下调表达基因，仅存在于湿热困脾证中，而在其他证型中未见有异常表达。它们分别是：CCR2、INPPL1、AKT2、

7、CEACAM1、NFKB1，这些基因均与2型糖尿病的发生和发展有密切的联系，本项目研究结果进一步证实它们与湿热困脾证有内在的联系。通过对糖尿病湿热困脾证的基因组学研究，深化了对“湿热困脾证”本质的理性认识，将宏观现象的研究与微观机理的探讨很好的结合，中医辨证施治侧重于宏观调控，对微观的揭示还不那么精确，诊断疾病的依据往往显得较为笼统，因而影响了“治未病”的普及运用。基因表达谱是从mRNA水准反映了细胞或组织特异性表型和表达模式，与临床上出现的症状和体征有着必然的内在联系，根据基因芯片结果提供的依据，不难预见糖尿病的