ACE2、PRR和AT2R在肾癌干细胞中的表达_孙爱军

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锦州医科大学学报２０２３Ｆｅｂ．４４（１）ＪＪｉｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ１ＡＣＥ２、ＰＲＲ和ＡＴ２Ｒ在肾癌干细胞中的表达１，２１孙爱军，佟明（１?锦州医科大学附属第一医院，辽宁锦州１２１０００；２?鞍山市肿瘤医院，辽宁鞍山１１５０００）摘要：目的探讨肾素－血管紧张素系统（ｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｓｙｓｔｅｍ，ＲＡＳ）成分在肾透明细胞癌（ｒｅｎａｌｃｌｅａｒｃｅｌｌｃａｒｃｉ⁃ｎｏｍａ，ＲＣＣＣ）中的肿瘤干细胞（ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＣＳＣｓ）上的表达情况，为ＲＡＳ抑制剂治疗ＲＣＣＣ提供理论依据。方法选出既有石蜡标本又有新鲜冷冻标本的ＲＣＣＣ组织样本。对样本的ＲＡＳ成分：肾素（Ｒｅｎｉｎ）、肾素原受体（ｐｒｏｒｅｎｉｎｒｅｃｅｐ⁃ｔｏｒ，ＰＲＲ）、血管紧张素转换酶（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＡＣＥ）、血管紧张素转换酶２（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ２，ＡＣＥ２）和血管紧张素ＩＩ受体（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＴ２Ｒ）行免疫组化染色。用ＯＣＴ４或ＫＬＦ４作为ＣＳＣｓ标志物分别和以上ＲＡＳ成分进行免疫荧光共染色或免疫组化双染色。采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和ＲＴ－ｑＰＣＲ技术定量研究ＲＣＣＣ组织样本中这些ＲＡＳ组分的蛋白和基因表达情况。结果免疫组化染色显示，３５份ＲＣＣＣ样本中分别有３１份、３３份和３３份表达肾素、ＰＲＲ和ＡＣＥ２。所有３５份样本均表达ＡＴ２Ｒ，ＡＣＥ只在正常组织血管的内皮细胞中表达。双免疫组化双染色显示ＡＣＥ２定＋＋位于ＫＬＦ４ＣＳＣｓ上，肾素不表达在ＣＳＣｓ上。免疫荧光染色显示ＰＲＲ和ＡＴ２Ｒ定位于ＯＣＴ４ＣＳＣｓ上。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实除了肾素外，以上ＲＡＳ的蛋白成分都有表达。ＲＴ－ｑＰＣＲ显示了所有ＲＡＳ组分的转录表达，但ＡＴ２Ｒ未见表达。结论ＲＣＣＣ中ＣＳＣｓ表达ＰＲＲ、ＡＣＥ２和ＡＴ２Ｒ，通过靶向ＣＳＣｓ调控ＲＡＳ可能成为一种新的治疗ＲＣＣＣ的方法。关键词：肾透明细胞癌；肾素－血管紧张素系统；肿瘤干细胞中图分类号：Ｒ７３７文献标志码：Ａ文章编号：２０９６－３０５Ｘ（２０２３）０１－０００１－０７DOI:10.13847/j.cnki.lnmu.2023.01.019ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＥ２，ＰＲＲａｎｄＡＴ２ＲｉｎＲｅｎａｌＣａｒｃｉｎｏｍａＳｔｅｍＣｅｌｌｓ１，２１ＳｕｎＡｉｊｕｎ，ＴｏｎｇＭｉｎｇ（１?ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｚｈｏｕ１２１０００Ｃｈｉｎａ；２?ＡｎｓｈａｎＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，Ａｎｓｈａｎ１１１５００Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｓｙｓｔｅｍ（ＲＡＳ）ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｎｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＣＳＣｓ）ｉｎｒｅｎａｌｃｌｅａｒｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＲＣＣＣ）ａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒＲＡＳｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｔｏｔｒｅａｔＲＣＣＣｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＲＣＣＣｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈｂｏｔｈｐａｒａｆｆｉｎａｎｄｆｒｅｓｈｆｒｏｚｅｎｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｐｅｒ⁃ｆｏｒｍｅｄｆｏｒＲＡＳｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｒｅｎｉｎ，ｐｒｏｒｅｎｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＲＲ），ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ（ＡＣＥ），ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎ⁃ｚｙｍｅ２（ＡＣＥ２）ａｎｄａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＴ２Ｒ）．ＯＣＴ４ｏｒＫＬＦ４ｗｅｒｅｕｓｅｄａｓＣＳＣｓｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏ－ｓｔａｉｎｉｎｇｏｒｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅａｂｏｖｅＲＡＳｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔａｎｄＲＴ－ｑＰＣＲｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｓｔｕｄｙｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｈｅｓｅＲＡＳｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎＲＣＣＣｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ３１，３３ａｎｄ３３ｏｆ３５ＲＣＣＣｓａｍｐｌｅｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｒｅｎｉｎ，ＰＲＲａｎｄＡＣＥ２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｌｌ３５ｓａｍｐｌｅｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄＡＴ２Ｒ，ｗｈｉｌｅＡＣＥｗａｓｏｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌｓｉｎｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅ．ＤｏｕｂｌｅｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡＣＥ２ｗａｓ＋ｌｏｃａｔｅｄｏｎＫＬＦ４ＣＳＣｓ，ｗｈｉｌｅｒｅｎｉｎｗａｓｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎＣＳＣｓ．ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰＲＲａｎｄＡＴ２Ｒｗｅｒｅｌｏｃａ⁃＋ｔｅｄｏｎＯＣＴ４ＣＳＣｓ．ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔａｌｌｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＲＡＳｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｅｘｃｅｐｔｒｅｎｉｎ．ＲＴ－ｑＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌｌＲＡＳｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｂｕｔｎｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＴ２Ｒ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｎＲＣＣＣ，ＣＳＣｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄＰＲＲ，ＡＣＥ２ａｎｄＡＴ２Ｒ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＲＡＳｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＣＳＣｓｍａｙｂｅａｎｅｗｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒＲＣＣＣ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅｎａｌｃｌｅａｒｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｓｙｓｔｅｍ；ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［１］肾细胞癌（ｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＲＣＣ）是泌癌（ＲＣＣＣ）发生的比例最高。目前，ＲＣＣＣ的尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其中以肾透明细胞治疗效果仍取决于肿瘤的临床分期和分级。局灶性基金项目：辽宁省自然科学基金指导项目，项目编号：２０１７０５４０４０１。作者简介：孙爱军（１９８２），男，辽宁鞍山人，副主任医师，硕士学位，主要研究方向为肾癌的发生机制及治疗。通讯作者：佟明（１９６７），男，辽宁锦州人，教授，博士学位，主要研究方向为泌尿系统肿瘤及治疗。

1２锦州医科大学学报２０２３年２月，４４（１）肿瘤可通过部分或全肾切除术方式治疗，而传统化ＨＲＰ标记的二抗室温下孵育１ｈ，ＤＡＢ进行显色，疗和放射疗法的作用很小。而且，以上治疗的疗效苏木精复染细胞核，中性树胶封片，显微镜下观察［２］均存在较大差异性。近年来，肿瘤干细胞并拍照。同时，将上述肾素和ＡＣＥ２抗体以相同的（ＣＳＣｓ）的研究为肿瘤的发生理论以及治疗提供了稀释浓度分别与ＫＬＦ４（１∶２００）进行免疫组化双一个崭新的视野。研究证明在ＲＣＣＣ中存在ＣＳＣｓ，标染色，观察肾素和ＡＣＥ２在ＣＳＣｓ中的共定位情并具有降低放疗和化疗治疗中ＲＣＣＣ的抵抗或耐药况，二抗标记染色。ＤＡＢ和ＡＥＣ显色试剂进行显［３］作用。最近，在ＲＣＣＣ中发现了ＣＳＣｓ的亚群，色。其表达转录因子ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４和１?３免疫荧光双标染色［４］ｃ－ＭＹＣ等干细胞相关标记物。此外，ＣＳＣｓ在许干细胞标志物ＯＣＴ４分别与上述ＲＡＳ成分进多类型的癌症中都表达肾素－血管紧张素系统行共免疫荧光双标染色，观察ＲＡＳ成分和ＯＣＴ４（ＲＡＳ）成分。其中肾素、肾素原受体（ＰＲＲ）、在ＣＳＣｓ上的定位表达情况。一抗采用上述免疫组血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）、ＡＣＥ２、血管紧张素ＩＩ化染色中检测ＲＡＳ抗体成分相同的浓度进行，分受体１（ＡＴ１Ｒ）和血管紧张素ＩＩ受体２（ＡＴ２Ｒ）别与ＯＣＴ４（１∶３００）于４℃冰箱内孵育过夜。二［５］都与癌症的发生有关。本研究拟观察ＲＡＳ成分抗采用免疫荧光标记的抗鼠ＤｙＬｉｇｈｔ４８８和抗兔Ａｌ⁃在ＲＣＣＣ以及ＣＳＣｓ细胞中的表达情况，为进一步ｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（１∶５００）。激光共聚焦显微镜下观寻找靶向ＲＡＳ途径的新治疗方案，改善ＲＣＣＣ疾察并拍照。病提供参考依据。１?４图像获取与免疫组织化学染色评估采用显微镜、数码相机以及系统自带软件对免１实验材料与方法疫组化染色玻片进行拍照获取图片。免疫荧光染色１?１ＲＣＣＣ组织样本和试剂仪器采用生物共聚焦激光扫描显微镜观察成像，系统软选取ＲＣＣＣ患者的石蜡样本和低温冻存的样件进行计算处理。所有免疫组化／荧光图像的评估本，１８例来自女性，１７例来自男性，年龄３７～８８均由两名研究人员独立进行，采用盲测法，即评估岁（平均６５?８岁），肿瘤分级全部为２～３级，分人员对患者的临床病理和预后数据均不知情。当染期Ｔ～Ｔ，都没有淋巴远处转移。所选取的患者样色评估出现分歧时，由两名专家重新检查切片最终１３本均是首次发病且术前未经过药物或放化疗。组织达成一致意见。标本再次由两名有经验的病理学医师仔细分析，最１?５ＲＴ－ｑＰＣＲ分析终确定肿瘤的组织类型。兔抗ｒｅｎｉｎ、ＰＲＲ、ＡＣＥ、取冷冻ＲＣＣＣ组织样本，使用组织匀浆器对每ＡＣＥ２、ＡＴ２Ｒ、α－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体，鼠抗ＯＣＴ４抗体，个样本进行快速冷冻组织匀浆处理。然后，用ＴＲ⁃山羊抗ＫＬＦ４抗体，ＡＥＣ显示试剂（红），ＤＡＢ显Ｉｚｏｌ溶液提取总ＲＮＡ。脱氧核糖核酸酶消化。使用色试剂（棕），ＨＲＰ标记山羊抗兔ＩｇＧ，ＨＲＰ标记分光光度计对ＲＮＡ进行定量。逆转录成ｃＤＮＡ，驴抗兔ＩｇＧ，抗鼠ＤｙＬｉｇｈｔ４８８，抗兔ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ将目的基因进行转录扩增，反应条件：９４℃预变５９４均购于北京博奥森公司。ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ试剂盒，性２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，总ＧＡＰＤＨ、ＰＵＭ１、ＵＨＲ、ＥＣＬ显色试剂盒、ＢＣＡ试共循环５０次。基因表达内参基因为ＧＡＰＤＨ和剂盒、ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒、ＲＮＡｓｅＡ购于北京天恩泽ＰＵＭ１。人组织的总ＲＮＡ（ＵＨＲ）作为ＲＮＡ参考－△△Ｃｔ公司。设备有石蜡切片机、组织匀浆器、ＰＣＲ仪、值，用作２分析的校正基值。使用２％琼脂糖ＢＸ５３显微镜、微孔板酶标仪、激光共聚焦显微镜、凝胶电泳和ＩｍａｇｅＬａｂ６?０软件进行分析。计算Ｒｅ⁃分子成像系统、分光光度计。ｎｉｎ、ＰＲＲ、ＡＣＥ、ＡＴ１Ｒ及ＡＴ２ＲｍＲＮＡ的相对表１?２组织学及免疫组化染色达量。ＲＣＣＣ石蜡样本行４μｍ厚连续切片，ＨＥ染色各种基因的引物序列（５′→３′）：观察，再次确定肿瘤类型。６０℃下烤片，用二甲Ｒｅｎｉｎ：上游ＴＡＣＴＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＴＣＴＣＣ，下苯脱蜡和乙醇复水。用ｐＨ＝６?０的柠檬酸钠缓冲液游ＴＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＡＣＴＣ；修复抗原。用０?３％过氧化氢阻断内源性过氧化物ＰＲＲ：上游ＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡ，下酶活性１０ｍｉｎ，然后用５％ＢＳＡ血清阻断３０ｍｉｎ。游ＣＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣ；组织分别与相应的一抗孵育：肾素、ＰＲＲ、ＡＣＥ、ＡＣＥ：上游ＡＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＴ⁃ＡＣＥ２和ＡＴ２Ｒ（１∶２００），４℃冰箱过夜。次日用ＧＡＧ，下游ＴＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧ；

2孙爱军，等：ＡＣＥ２、ＰＲＲ和ＡＴ２Ｒ在肾癌干细胞中的表达３ＡＣＥ２：上游ＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＣＣ，下游ＣＣ。免疫组化染色显示３１例ＲＣＣＣ样本肾素呈弱ＴＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣ；～中度胞浆染色（见图１Ａ）。有３３例显示ＰＲＲ呈ＡＴ１Ｒ：上游ＡＧＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＣＡＧ；胞浆表达，染色强度不同（见图１Ｂ）。在所有样本下游ＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＧＡＡＧ；ＡＴ２Ｒ：上中，ＡＣＥ均在正常血管的内皮处表达，而在肿瘤游ＴＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＴＧＧ；下游ＣＴＧＣＧ⁃组织内均未见表达（见图１Ｃ）。在３３例样本中ＧＡＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣ；ＡＣＥ２表现为非均质的膜染色，其中有２８例带有ＧＡＰＤＨ：上游ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧ，下颗粒状胞浆染色（见图１Ｄ）。ＡＴ２Ｒ在全部肿瘤样游ＴＴＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＡ；本中均表达，染色模式表现为胞浆染色，其中２３ＰＵＭ１：上游ＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣ；例有个别核染色（见图１Ｅ）。下游ＣＴＧＧＡＧＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＡ。表１３５例肾透明细胞癌患者的临床一般资料１?６ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测项目ｎ百分率（％）另取冷冻ＲＣＣＣ样品置于冷的缓冲液中，研磨性别男１７４８?６０提取总蛋白，ＢＣＡ试剂盒蛋白定量。２０μｇ总蛋白女１８５１?４０通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚二氟肿瘤分级２期１６４５?７０乙烯膜。使用ＰＲＲ、ＡＣＥ、ＡＣＥ２、ＡＴ２Ｒ和α－微３期１９５４?３０管蛋白一抗（１∶５００）进行孵育。ＰＲＲ、ＡＣＥ和肿瘤分期Ｔ１Ｎ０Ｍ０５１４?３０ＡＣＥ２采用辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记山羊抗兔Ｔ２Ｎ０Ｍ０１８５１?４０二抗（１∶５００），ＡＴ２Ｒ用ＨＲＰ标记的驴抗兔ＩｇＧ，Ｔ３Ｎ０Ｍ０１２３４?３０α－微管蛋白用ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８标记的驴抗鼠（１∶现状生存２６７４?３０１０００）进行检测。ＥＣＬ进行显色，ＩｍａｇｅＬａｂ６?０死亡９２５?７０软件对条带进行检测和分析。２?２ＡＣＥ２、ＰＲＲ、ＡＴ２Ｒ和Ｒｅｎｉｎ在ＣＳＣｓ中共表１?７统计学方法达情况对于满足正态性、方差齐性多组数据间比较，＋免疫组化双染显示ＲＣＣＣ组织样本中，ＫＬＦ４采用方差分析（ＡＮＯＶＡ）。对于不符合正态性或方＋的ＣＳＣｓ上未见肾素表达（图２Ａ）。而ＫＬＦ４的差不齐的数据采用非参数的单因素方差分析并行ＫＣＳＣｓ中ＡＣＥ２也同时呈阳性表达（见图２Ｂ）。阳－Ｗ检验。两两比较采用事后ｔ检验，以Ｐ＜０?０５性对照显示肾素在支气管中为胞浆染色阳性（见为差异有统计学意义。图３Ａ），ＡＣＥ２在肾脏中呈胞浆染色阳性（见图２结果３Ｂ），ＫＬＦ４在结肠上皮中为核染色阳性（见图３Ｃ）。同型阴性对照在支气管、肾脏和结肠均未见２?１肾素、ＡＣＥ２、ＰＲＲ和ＡＴ２Ｒ在ＲＣＣＣ中免疫染色（见图３Ｄ～Ｆ）。免疫荧光染色显示，在ＲＣ⁃组化表达＋ＣＣ组织样本中，ＯＣＴ４的ＣＳＣｓ胞浆中可见ＰＲＲ对３５例ＲＣＣＣ患者的临床一般资料进行分析，表达于胞浆中（见图４Ａ），ＡＴ２Ｒ主要表达于性别、年龄、肿瘤分级和分期都没有统计学差异，＋ＯＣＴ４的ＣＳＣｓ胞核内（见图４Ｂ）。见表１。经ＨＥ染色证实选取的所有组织样本均为ＲＣ⁃

3４锦州医科大学学报２０２３年２月，４４（１）Ａ：肾素，表达在肿瘤细胞胞浆中，呈棕色染色；Ｂ：ＰＲＲ，肿瘤细胞胞浆呈棕色染色；Ｃ：ＡＣＥ，肿瘤内未见表达；Ｄ：ＡＣＥ２，主要表达在肿瘤细胞的胞膜和胞浆中；Ｅ：ＡＴ２Ｒ，表达在肿瘤细胞的胞浆和胞核中；Ｆ：同型阴性对照，标尺：２０μｍ图１肾透明细胞癌组织免疫组化图像＋＋Ａ：ＫＬＦ４（棕色）的ＣＳＣｓ上不表达肾素（红色）；Ｂ：ＫＬＦ４（棕色）的ＣＳＣｓ表达ＡＣＥ２（红色），标尺：２０μｍ图２ＣＳＣｓ免疫组化双染色图Ａ：肾素阳性对照，人支气管（红色）；Ｂ：ＡＣＥ２阳性对照，肾脏（红色）；Ｃ：ＫＬＦ４阳性对照，结肠上皮（棕色）；Ｄ：同型阴性对照显示支气管（无红色）；Ｅ：同型阴性对照肾脏；Ｆ：结肠上皮无染色（无棕色），标尺：２０μｍ图３ＣＳＣｓ免疫组化双染色阳性和阴性对照图

4孙爱军，等：ＡＣＥ２、ＰＲＲ和ＡＴ２Ｒ在肾癌干细胞中的表达５＋Ａ：ＰＰＲ（红色）和ＯＣＴ４（绿色）共表达于ＣＳＣｓ上；Ｂ：ＯＣＴ４（绿色）ＣＳＣｓ上同时有ＡＴ２Ｒ表达（红色），标尺：２０μｍ图４ＣＳＣｓ免疫荧光双标染色图２?３Ｒｅｎｉｎ、ＰＲＲ、ＡＣＥ、ＡＣＥ２和ＡＴ１Ｒ基因表达与健康人的ＵＨＲ相比，肾素ｍＲＮＡ水平升高（见图５）。３５份ＲＣＣＣ组织样本中有３０份检测到肾素。其中５个样本的表达水平与健康ＵＨＲ相当，而其他２５个样本高于健康ＵＨＲ的表达水平。只有６个样本检测到ＡＴ１Ｒ。在健康的ＵＨＲ中检测到ＡＴ２Ｒ，然而所有ＲＣＣＣ样本中均未检测到ＡＴ２Ｒ。ＰＣＲ产物凝胶电泳特异性扩增图，可观察到符合预期大小的扩增条带，见图６。图５ＲＴ－ｑＰＣＲ检测肾素、ＰＲＲ、ＡＣＥ、ＡＣＥ２、ＡＴ１Ｒ和ＡＴ２Ｒ基因表达Ａ：肾素；Ｂ：ＰＲＲ；Ｃ：ＡＣＥ；Ｄ：ＡＣＥ２；Ｅ：ＡＴ１Ｒ；Ｆ：ＡＴ２Ｒ；Ｇ：ＧＡＰＤＨ；Ｈ：ＰＵＭ１；１～６列为各组织样本；ＵＨＲ：人通用ＲＮＡ内参；Ｐｏｓ：阳性对照；ＮＴＣ：无模板对照图６ＲＴ－ｑＰＣＲ扩增ＲＣＣＣ组织样本ＲＡＳ成分ｍＲＮＡ的表达２?４ＲＣＣＣ中ＰＲＲ、ＡＣＥ、ＡＣＥ２和ＡＴ２Ｒ免疫印个样品在１９５ｋＤａ位置上检测到ＡＣＥ表达（见图迹表达７Ｂ）。所有ＲＣＣＣ中有３１个在１１０ｋＤａ位置检测到ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ显示在ＲＣＣＣ组织样本表达了ＡＣＥ２表达（见图７Ｃ）。在所有样本中，有３０个ＰＲＲ、ＡＣＥ、ＡＣＥ２和ＡＴ２Ｒ蛋白，表现为在ＰＲＲ、样本在约为４８ｋＤａ的位置检测到了ＡＴ２Ｒ表达ＡＣＥ、ＡＣＥ２和ＡＴ２Ｒ的预期分子量位置出现了目（见图７Ｄ）。用各种抗体对肾素进行免疫印迹检标条带（见图７）。其中ＰＲＲ在所有样本的２１ｋＤａ测，未能观察到单一的特异性条带。α－微管蛋白位置上表达，部分样本发现在３５ｋＤａ位置上有全在每个样品中的总蛋白载量基本相同。长同型跨膜结构的表达。在３５个ＲＣＣＣ中，有３２

5６锦州医科大学学报２０２３年２月，４４（１）Ａ：ＰＲＲ（红色）；Ｂ：ＡＣＥ（红色）；Ｃ：ＡＣＥ２（红色）；Ｄ：ＡＴ２Ｒ（红色）；Ｅ：α－Ｔｕｂｕｌｉｎ（红色）图７肾透明细胞癌组织中ＰＲＲ，ＡＣＥ，ＡＣＥ２，ＡＴ２Ｒ表达的免疫印迹图［７］文献的报道相一致。免疫印迹中发现在４８ｋＤａ３讨论的位置处检测到ＡＴ２Ｒ，这比４１ｋＤａ的ＡＴ２Ｒ理论本研究证实了在ＲＣＣＣ中可以检测到ＲＡＳ的５分子量更大，原因应该是其存在糖基化形式。通过［８］种成分即：肾素、ＰＲＲ、ＡＣＥ２、ＡＴ１Ｒ和ＡＴ２Ｒ，同型对照试验证实了额外的非特异性带的出现。＋其中ＰＲＲ、ＡＣＥ２和ＡＴ２Ｒ定位于ＲＣＣＣ中表达免疫组化双染色显示ＫＬＦ４的ＣＳＣｓ表达［５］ＯＣＴ４、ＫＬＦ４的ＣＳＣｓ上。这些结果为ＲＡＳ与肾ＡＣＥ２，即ＫＬＦ４和ＡＣＥ２共表达。免疫荧光共染色＋脏癌变之间的关联提供了较直接的证据。免疫组化显示ＰＲＲ和ＡＴ２Ｒ定位于ＲＣＣＣ中的ＯＣＴ４的染色显示：全部的ＲＣＣＣ组织标本中均有ＡＴ２Ｒ表ＣＳＣｓ上。免疫组化双染色未见肾素表达，这可能达，大部分标本中有Ｒｅｎｉｎ、ＰＲＲ、ＡＣＥ２表达。是由于ＫＬＦ４过染，可能掩盖了单一免疫组化染色对冷冻保存的ＲＣＣＣ标本进行免疫印迹和ＲＴ－显示的肾素弱染色。也可能是由于抗体相互作用干ｑＰＣＲ检测，证实了免疫组化染色检测到的ＰＲＲ和扰了单一免疫组化染色。ＡＣＥ２蛋白的ｍＲＮＡ水平上的表达。在部分样本我们没有在肿瘤内部检测到ＡＣＥ，然而，在中，免疫印迹法证实了ＡＴ２Ｒ的表达，然而ＲＴ－周围正常的血管组织中却能检测到它，这与其他人［８］ｑＰＣＲ法却未检测到ＡＴ２Ｒ的ｍＲＮＡ表达。免疫印的报道一致。这提示在ＲＣＣＣ中ＡＣＥ功能缺失，迹法未检测到肾素表达，但是用ＲＴ－ｑＰＣＲ却证实但这也并不排除ＡＴＩ向ＡＴＩＩ的局部转化的可能。了其转录水平上有表达。我们发现ＰＲＲ在免疫印因为有一些酶，如乳糜酶可以促进或构成ＲＡＳ的［９］迹条带上出现在２１ｋＤａ和３５ｋＤａ位置上，而ＰＲＲ旁路转化途径。预期印迹条带（分子量）包括大约２８ｋＤａ的可溶在ＲＣＣＣ中ＡＣＥ２的表达表明ＡＣＥ、ＡＣＥ２表［６］性亚型和３５ｋＤａ的跨膜形式。又由于２１ｋＤａ条达与生存期无显著相关性。然而，本研究有限的样带在阴性对照和兔ＩｇＧ同型对照中均未能检测到，本量限制了我们的研究与存活率的相关性分析。最所以免疫印迹法检测到的２１ｋＤａ条带表明ＰＲＲ蛋近的一项研究也发现，在ＲＣＣＣ中ＡＣＥ２表达增［１０］白可能是以降解的形式存在。通过进一步的分析，加，并且表达增加与生存率提高相关。这些发我们认为免疫印迹法和ＲＴ－ｑＰＣＲ法检测的ＡＣＥ表现也在其他的研究中有所反映，其中ＲＣＣＣ中［１１］达结果反映的可能是免疫组化染色中所见的正常血ＡＣＥ２的下调与生存率较差相关。管组织的表达，而不是肿瘤本身的表达。如免疫印此外，通过免疫组化和免疫荧光染色，在迹所示，表达ＡＣＥ的样本同时也表达ＡＣＥ２，这与ＣＳＣｓ的细胞质和细胞核中均发现了ｇ偶联跨膜蛋

6孙爱军，等：ＡＣＥ２、ＰＲＲ和ＡＴ２Ｒ在肾癌干细胞中的表达７白ＡＴ２Ｒ。这表明ＡＴ２Ｒ作为跨膜蛋白和核受体在２４（１）：９９－１０４．功能上存在不同的定位。有人认为，ＡＴ２Ｒ的核定［５］ＣｌａｒａＪＡ，ＭｏｎｇｅＣ，ＹａｎｇＹ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈ⁃ｗａｙｓａｎｄｔｈｅｉｍｍｕｎｅｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ—ａ位可能通过转录调控放大膜性ＡＴ２Ｒ的作用或调节ｃｌｉｎｉｃａｌｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，２０２０，１７（４）：２０４［１２］膜性ＡＴ２Ｒ的激活。免疫印迹检测到ＡＴ２Ｒ表达－２３２．较弱，而ＲＴ－ｑＰＣＲ则没检测到ＡＴ２Ｒ。这可能是［６］ＳｈｅｎＣＹ，ＹａｎｇＣ，ＸｉａＢ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ：Ｅ⁃由于本研究使用的ＲＴ－ｑＰＣＲ引物可能没有完全覆ｍｅｒｇｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｆｏｒｃｈｅｍｏ／ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｃａｎｃｅｒ盖ＡＴ２Ｒ所有可能的剪接变异体。另外，ｍＲＮＡ降ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ，２０２０，１１：２４４－２５２．［７］ＹａｎｇＬ，ＳｈｉＰ，ＺｈａｏＧ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｐａｔｈ⁃解可能导致了ＡＴ２ＲｍＲＮＡ的缺失从而造成检测不ｗａｙｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＴａｒｇｅｔＴｈｅｒ，到。在ＲＣＣＣ中检测到ＡＴ２Ｒ的低水平表达也与２０２０，５（１）：８－１８．ＡＴ２Ｒ对癌症的保护作用相一致，但是具体的原因［８］ＫｉｌｍｉｓｔｅｒＥＪ，ＰａｔｅｒｓｏｎＣ，ＢｒａｓｃｈＨ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｔｈｅｒｅ⁃［１３］和机制仍需要进一步研究。ｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｖｉｔａｍｉｎＤｉｎｋｅｌｏｉｄｄｉｓｏｒｄｅｒ—ａｒｅ⁃由于同时具有新鲜冷冻组织标本和石蜡标本的ｖｉｅｗ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＳｕｒｇ，２０１９，６：６７－７５．［９］ＳｉｌｊｅｅＳ，ＰｉｌｋｉｎｇｔｏｎＴ，ＢｒａｓｃｈＨＤ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎ样本不是太多，最终导致本研究的样本数量不是很ｈｅａｄａｎｄｎｅｃｋｍｅｔａｓｔａｔｉｃｍａｌｉｇｎａｎｔｍｅｌａｎｏｍａｅｘｐｒｅｓｓｃｏｍｐｏ⁃充分。对肿瘤的亚群进一步分析和研究则需要收集ｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ，２０２０，１０更大的样本量。最后，本研究结果提示通过调控（１１）：２６８－２７６．ＲＡＳ成分，ＣＳＣｓ有可能成为一个新的潜在的治疗［１０］ＳａｙｇｉｎＣ，ＭａｔｅｉＤ，ＭａｊｅｔｉＲ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｃａｎｃｅｒｓｔｅｍ⁃靶点。ｎｅｓｓｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｃ：ｆｒｏｍｈｙｐｅｔｏｈｏｐｅ［Ｊ］．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，２０１９，２４（１）：２５－４０．参考文献：［１１］ＮａｒａｙａｎａｎＡ，ＷｉｃｋｒｅｍｅｓｅｋｅｒａＳＫ，ｖａｎＳｃｈａｉｊｉｋＢ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｌｉｖｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓｆｒｏｍｃｏｌｏｎａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［１］ＣａｔａｒａｔａＭＪ，ＲｉｂｅｉｒｏＲ，ＯｌｉｖｅｉｒａＭＪ，ｅｔａｌ．Ｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｅｘｐｒｅｓｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊｓｙｓｔｅｍｉｎｌｕｎｇｔｕｍｏｒａｎｄｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＭｅｔａｓｔａｓｉｓＴｒｅａｔ，２０１９，５：３６－４４．Ｃａｎｃｅｒｓ，２０２０，１２（６）：１４５７－１４６３．［１２］ＳｃｈａｉｊｉｋＢＶ，ＤａｖｉｓＰＦ，ＷｉｃｋｒｅｍｅｓｅｋｅｒａＡＣ，ｅｔａｌ．Ｓｕｂｃｅｌｌｕ⁃［２］ＦｅａｔｈｅｒｓｔｏｎＴ，ＢｒａｓｃｈＨＤ，ＳｉｌｊｅｅＳＤ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＳｔｅｍＣｅｌｌｓｌａｒｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｍａｒｋｅｒｓＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ｉｎＨｅａｄａｎｄＮｅｃｋＣｕｔａｎｅｏｕｓＳｑｕａｍｏｕｓＣｅｌｌＣａｒｃｉｎｏｍａＥｘｐｒｅｓｓＮＡＮＯＧ，ＫＬＦ４ａｎｄｃ－ＭＹＣｉｎｃａｎｃｅｒ：Ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＣａｔｈｅｐｓｉｎｓ［Ｊ］．ＰＲＳＧｌｏｂＯｐｅｎ，２０２０，８（８）：ｅ３０４２－Ｐａｔｈｏｌ，２０１８，７１（１）：８８－９１．ｅ３９８３．［１３］ＦａｔｔｏｒｅＬ，ＲｕｇｇｉｅｒｏＣＦ，ＰｉｓａｎｕＭＥ，ｅｔａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ［３］ＦｅｎｇＨ，ＷｅｉＸ，ＰａｎｇＬ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｍｉＲＮＡｓｇｌｏｂａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｒｕｇｒｅ⁃ＶａｌｕｅｏｆＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇＥｎｚｙｍｅ２ｉｎＰａｎ－Ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＢＲＡＦｍｕｔａｔｅｄｍｅｌａｎｏｍａ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ，ＦｒｏｎｔＭｏｌＢｉｏｓｃｉ，２０２０，７：１８９．２０１９，２６（７）：１２６７－１２８２．［４］ＧｕｒｅｌＣ，ＩｎｅｔａｓＧ，ＨｏｒｔｕＩ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒａｎｄｃａｎｃｅｒｓｔｅｍ收稿日期：２０２２－０９－２４ｃｅｌｌｓ：Ｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃｏｇ，２０１９，