BJS 202205 甘蔗及甘蔗汁中3-硝基丙酸的测定

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食品补充检验方法犅犑犛２０２２０５甘蔗及甘蔗汁中３硝基丙酸的测定２０２２０２０７发布国家市场监督管理总局发布

1犅犑犛２０２２０５甘蔗及甘蔗汁中３硝基丙酸的测定１范围本方法规定了甘蔗及甘蔗汁中３硝基丙酸高效液相色谱法的测定方法。本方法适用于甘蔗及甘蔗汁中３硝基丙酸的测定。当样品中检出３硝基丙酸时，可用高效液相色谱串联质谱联用法进行确证。２原理用水提取甘蔗及甘蔗汁中的３硝基丙酸，提取液调ｐＨ后经乙酸乙酯萃取，经反相高效液相色谱测定，外标法定量。３试剂和材料注：除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水为符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。３．１试剂３．１．１甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱纯。３．１．２乙酸乙酯（ＣＨ３ＣＯＯＣ２Ｈ５）。３．１．３磷酸（Ｈ３ＰＯ４）。３．１．４磷酸氢二铵［（ＮＨ４）２ＨＰＯ４］。３．１．５甲酸（ＨＣＯＯＨ）：色谱纯。３．２试剂配制３．２．１磷酸溶液（１＋９）：量取１０ｍＬ磷酸（３．１．３），加水９０ｍＬ，混匀。３．２．２磷酸氢二铵溶液（ｐＨ２．０）：称取磷酸氢二铵１．５ｇ（３．１．４），用水溶解，加水稀释至１０００ｍＬ，用磷酸溶液（３．２．１）调ｐＨ为２．０±０．１，混匀。３．２．３０．１％甲酸水溶液：取１ｍＬ甲酸（３．１．５），加水稀释至１０００ｍＬ，混匀。３．２．４磷酸水溶液（ｐＨ２．０）：取１００ｍＬ水，用磷酸溶液（３．２．１）调ｐＨ为２．０±０．１，混匀。３．３标准品３硝基丙酸的名称、ＣＡＳ号、分子式、相对分子质量、结构式见附录Ａ中表Ａ．１，纯度≥９７％，或采用国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．４标准溶液配制３．４．１标准储备液（１ｍｇ／ｍＬ）：准确称取５０ｍｇ（精确至０．１ｍｇ）标准品，置于５０ｍＬ容量瓶中，加适量的水溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为１ｍｇ／ｍＬ的标准储备液。４℃避光保存，有效期６个月。３．４．２标准中间液（０．１ｍｇ／ｍＬ）：吸取标准储备液（３．４．１）１０．０ｍＬ于１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻１

2犅犑犛２０２２０５度，摇匀，制成质量浓度为０．１ｍｇ／ｍＬ的标准中间液。４℃避光保存，有效期３个月。３．４．３标准工作液：吸取标准中间液（３．４．２）２．０ｍＬ、３．０ｍＬ、５．０ｍＬ、１０．０ｍＬ、２０．０ｍＬ、４０．０ｍＬ，置于１００ｍＬ容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，得３硝基丙酸标准溶液的最终质量浓度分别为２．０μｇ／ｍＬ、３．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、２０．０μｇ／ｍＬ、４０．０μｇ／ｍＬ的标准系列工作溶液。各实验室可在实际应用时根据情况调整标准系列工作溶液浓度。３．５材料３．５．１微孔滤膜：０．４５μｍ，有机相。３．５．２微孔滤膜：０．２２μｍ，有机相。４仪器和设备４．１高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器。４．２超声波水浴。４．３高速离心机：转速≥１００００ｒ／ｍｉｎ。４．４涡漩混合器。４．５组织捣碎机。４．６ｐＨ计：精确至０．１。４．７电子天平：感量分别为０．００１ｇ和０．１ｍｇ。４．８氮吹仪。５分析步骤５．１试样制备５．１．１甘蔗取不少于２０ｇ的去皮甘蔗样品，将其切成若干段，再切成小于０．５ｃｍ的块后放入组织搅碎机中搅碎，混匀后置于洁净的容器中密封备用，备样于－２０℃贮存。样品应及时测定，临用现制。５．１．２甘蔗汁充分混匀，直接取用；若不能及时测定，应于－２０℃储存。５．２试样前处理称取试样２ｇ（精确至０．００１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加水１０ｍＬ，超声提取１０ｍｉｎ，用磷酸溶液（３．２．１）调ｐＨ至２．０±０．１，加入１０ｍＬ乙酸乙酯（３．１．２），涡漩１ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，将上清液转移到另一５０ｍＬ离心管中，用１０ｍＬ乙酸乙酯（３．１．２）重复提取一次，合并上清液。在乙酸乙酯萃取液中加磷酸水溶液（ｐＨ２．０）（３．２．４）１０ｍＬ，涡漩１ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液。于４５℃氮气吹至近干，加入水１．０ｍＬ溶解残渣，过０．４５μｍ滤膜，取续滤液，上机测定。５．３仪器参考条件仪器参考条件如下。ａ）色谱柱：ＡｇｅｌａＶｅｎｕｓｉｌＭＰＣ１８柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），或性能相当者。２

3犅犑犛２０２２０５ｂ）流动相：磷酸氢二铵溶液（ｐＨ２．０）（３．２．２）与甲醇（３．１．１）的体积比为９６∶４。ｃ）流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。ｄ）检测波长：２１０ｎｍ。ｅ）柱温：３０℃。ｆ）进样量：２０μＬ。５．４测定５．４．１定性测定按照５．２的条件测定试样和标准工作液，试样中待测物与标准品溶液色谱峰保留时间的相对偏差不大于２．５％，且与相近质量浓度标准品溶液的色谱图最大吸收处的光谱图一致，则可初步判定试样中存在３硝基丙酸，可按附录Ｂ方法进行确证。３硝基丙酸标准溶液的色谱图参见附录Ｃ中图Ｃ．１。５．４．２定量测定将待测试样液注入高效液相色谱仪中，得到３硝基丙酸的峰面积，根据标准曲线计算得到试样液中３硝基丙酸的质量浓度。试样溶液中３硝基丙酸的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。５．５空白试验除不加试样外，均按试样同法操作。６结果计算结果按式（１）计算：犡＝ρ×犿犞××１１００００００…………………………（１）式中：犡———试样中３硝基丙酸的含量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；ρ———试样测定溶液中３硝基丙酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———试样的质量，单位为克（ｇ）。计算结果需扣除空白值，测定结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留３位有效数字。７精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。８其他当取样量为２ｇ时，本方法检出限为０．３ｍｇ／ｋｇ，定量限为１．０ｍｇ／ｋｇ。３

4犅犑犛２０２２０５附录犃（资料性）３硝基丙酸的中文名称、英文名称、犆犃犛号、分子式、相对分子质量和结构式３硝基丙酸的中文名称、英文名称、ＣＡＳ号、分子式、相对分子质量和结构式见表Ａ．１。表犃．１３硝基丙酸的中文名称、英文名称、犆犃犛号、分子式、相对分子质量和结构式中文名称英文名称ＣＡＳ号分子式相对分子质量结构式３硝基丙酸３ｎｉｔｒｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ５０４８８１Ｃ３Ｈ５ＮＯ４１１９．０８４

5犅犑犛２０２２０５附录犅（资料性）３硝基丙酸液相色谱质谱／质谱确证犅．１液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下。ａ）色谱柱：ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＣ１８柱（１．７μｍ，２．１ｍｍ×１００ｍｍ），或其他等效柱。ｂ）流动相：Ａ为０．１％甲酸水溶液（３．２．３），Ｂ为甲醇（３．１．１），梯度洗脱条件见表Ｂ．１。ｃ）流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ。ｄ）柱温：３０℃。ｅ）进样量：５μＬ。表犅．１流动相梯度洗脱程序时间／ｍｉｎ流动相Ａ／％流动相Ｂ／％０．０９５５３．０９５５４．０６０４０４．１９５５５．０９５５犅．２质谱参考条件质谱参考条件如下。ａ）离子源：电喷雾离子源（ＥＳＩ）。ｂ）检测方式：多反应监测（ＭＲＭ）。ｃ）扫描方式：负离子模式扫描。ｄ）电喷雾电压：－２．５ｋＶ。ｅ）脱溶剂温度：４５０℃。ｆ）定性／定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表Ｂ．２。表犅．２待测物质的定性／定量离子对、锥孔电压和碰撞能量中文名称检测方式母离子（犿／狕）子离子（犿／狕）锥孔电压／Ｖ碰撞能量／ｅＶ３硝基丙酸ＭＲＭ１１８．０４６．０３０１２Ｂ．２所列仪器条件仅供参考，采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳，并根据仪器灵敏度调整浓度。犅．３定性判定按照Ｂ．１和Ｂ．２的条件测定试样和标准溶液。试样和浓度接近的标准溶液同时进样分析，试样中被测物质的多反应监测（ＭＲＭ）色谱峰保留时间与标准品的保留时间偏差在±２．５％之内，且有相同的５

6犅犑犛２０２２０５定性离子，可以确定试样中检出相应化合物。３硝基丙酸多反应监测（ＭＲＭ）色谱图见图Ｂ．１。图犅．１标准品多反应监测（犕犚犕）色谱图６

7犅犑犛２０２２０５附录犆（资料性）３硝基丙酸标准溶液液相色谱图３硝基丙酸标准溶液液相色谱图见图Ｃ．１。图犆．１３硝基丙酸标准高效液相色谱图（保留时间７．２５５犿犻狀）本方法负责起草单位：黑龙江省药品检验研究院。本方法验证单位：山东省食品药品检验研究院、山西省食品药品检验所、哈尔滨市产品质量监督检验院、四平市食品药品检验所、黑龙江省华测检测技术有限公司。本方法主要起草人：姜连阁、王晰锐、王子谛、多凯、庄舒翔、朱琳、谭慧、马占峰。７