小鼠实验胚胎技术与应用-黄冰课件

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1、小鼠实验胚胎技术与应用眼科学实验动物中心黄冰提纲一、小鼠实验胚胎技术1、母鼠超数排卵2、胚胎收集3、胚胎体外培养4、假母制备5、胚胎体内移植二、应用:转基因动物模型的制作1、定义2、制作方法和原理小鼠实验胚胎技术超数排卵：给予发情间期的母鼠一定量的促进卵泡成熟和卵子排放的激素，母鼠可以同时段排放比正常排卵数多一倍以上的成熟卵子。PMSG（孕马血清促性腺激素）：促进卵泡成熟。HCG（人绒毛膜促性腺激素）：促进卵泡成熟和卵子排放。假母：性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，子宫内膜会处于增殖和接受胚胎着床的生理状态。一

2、旦有胚胎进入子宫腔内，胚胎便可以在其子宫内着床发育成个体。鼠类动物、兔子有此特性，其他动物需借助激素。小鼠实验胚胎技术的应用----转基因动物模型的制作转基因动物:转基因动物(transgenicanimal)是指以实验手段导入的外源基因在其基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。转基因动物模型:转基因动物模型(transgenicanimalmodel)是指利用转基因动物制作手段导入的人类疾病基因在其基因组稳定整合、遗传并表达产生类似于人类疾病的一类动物。LIM1基因敲除无脑小鼠震颤小鼠与多发性硬化震颤小

3、鼠与多发性硬化转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理构建的载体通过同源重组方式整合入动物个体基因组的特定位点克隆目的基因精子载体法构建载体雄原核注射法胚胎感染法曲细精管注射法胚胎干细胞法核移植法目的基因随机整合入动物个体基因组目的基因转录、翻译产生蛋白和表现功能转基因动物靶基因不能转录、翻译，不能产生蛋白和表现功能靶基因被删除或灭活基因敲除动物精体载体法：将外源基因附着在精子上，通过体外受精或单精子注射法将外源基因导入受精卵；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。精体载体法流程图目的基因克隆、

4、纯化与精子共孵育卵子体外受精或单精子注射受精卵DNA复制，外源基因整合双细胞期胚胎假母体内移植产生个体外源基因阳性个体筛选阳性个体的培育和建群精子载体法精体载体法特点：优点：简单不需要构件特殊的载体单纯的外源基因DNA片段缺点：成功率低雄原核注射法：通过显微注射的方法将外源基因注射入受精卵的雄原核区；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。雄原核注射法流程图目的基因克隆、纯化显微注射至受精卵雄原核受精卵DNA复制，外源基因整合双细胞期胚胎假母体内移植产生个体外源基因阳性个体筛选阳性个体的培育和建

5、群雄原核注射法特点：优点：相对简单、成功率高不需要构件特殊的载体单纯的外源基因DNA片段成功率可达5%～25%缺点：需要昂贵的仪器设备显微注射仪、拉针仪、煅针仪胚胎感染法：将外源基因连接上逆转录病毒载体，再让逆转录病毒载体感染着床前后的胚胎，外源基因随机整合入受体基因组。胚胎感染法流程图目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建体外感染着床前胚胎体内感染着床前、后胚胎（共孵育或显微注射）（输卵管或子宫内注射）胚胎移植产生个体筛选阳性嵌合体嵌合体之间交配外源基因阳性纯合个体产生、筛选外源基因阳性个体的培育和建群胚

6、胎感染法特点：优点：感染率高缺点：相对复杂存在生物安全性问题形成嵌合体后期工作量大曲细精管注射法：将外源基因注射入雄性动物的曲细精管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随机整合入受体基因组，再通过精卵受精产生带有外源基因的个体。曲细精管注射法流程图目的基因克隆、纯化逆转录病毒载体的构建雄性个体曲细精管注射外源基因随机整合入雄性生殖细胞雌、雄动物自然交配产生个体外源基因阳性个体筛选阳性个体的培育和建群曲细精管注射法特点：优点：相对简单不需要昂贵仪器缺点：成功率较低胚胎干细胞法：将外源基因转染胚胎干细胞，再通过嵌合体

7、技术或核移植技术产生带有外源基因的胚胎干细胞来源的转基因个体。胚胎干细胞法流程图目的基因克隆、纯化转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选受体囊胚腔注射核移植至受体卵母细胞胚胎移植胚胎移植产生嵌合体产生阳性克隆个体嵌合体之间交配外源基因纯合阳性个体筛选阳性个体的培育和建群嵌合体动物：组成一个动物个体的细胞来源于两个或两个以上的动物品系或品种。嵌合体动物制作方法：一、聚合法1.胚胎-胚胎：两个8细胞期~桑椹期的胚胎去透明带后，在植物血凝素的作用下，互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎，移植后发育成一个个体。2.胚胎-胚胎干细

8、胞：一个8细胞期~桑椹期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝素的作用下，形成一个融合胚胎，移植后发育成一个个体。聚合法的特点：不需要昂贵仪器，但成功率低。二、显微注射法1.成体细胞：将成体细胞显微注射入囊胚期胚胎囊腔，移植后发育成一个个体。2.胚胎干细胞：将胚胎干细胞显微注射入囊胚期胚胎囊腔，移植后发育成一个个体。显微注射法的特点：需昂贵仪器，但成功率高。成体细胞不具有体外无限增殖能力，不适于进行遗传修