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《亚型禽流感血凝抑制试验课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
内容1、血凝试验(HA)：检测抗原的效价2、血凝抑制试验(HI)：检测抗体3、注意事项
1材料1、90°的96孔微量反应板、单道及多道微量移液器、吸头、加样槽、烧杯、吸管、量杯、微量振荡器；2、H7亚型禽流感抗原、阴阳性血清、稀释液（PBS）；
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3实验原理1、HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞不流淌）。病毒颗粒红细胞
42、HI原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。Iamlate！抗体抗原
5血凝试验（HA)1、血凝板上的1-12孔每孔加入25ul生理盐水2、在第1孔内加入25ul抗原，反复吸吹3-5次使其混匀，然后从第一孔吸取25ul加入到第二孔，又反复洗吹3.5次吸取25ul加入到第三孔，依次倍比稀释至第11孔，最后从11孔弃去25ul3、每孔再次加入生理盐水25ul4、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul5、在振荡器上振荡均匀后，放于室温（20-25°C）下静置30分钟，或2-8℃45-60分钟，红细胞对照孔呈纽扣状时判定结果。6、结果判定。将反应板倾斜60°，观察红细胞有无泪滴状流淌，完全凝集无泪珠状流淌（100%）的最高稀释倍数为抗原血凝价。
61234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×红细胞对照生理盐水252525252525252525252525抗原生理盐水25252525252525252525252525252525252525252525弃2525红细胞252525252525252525252525结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+＋＋＋+＋＋＋++++++－－（红细胞沉积在底部）抗原效价测定
7抗原效价29
84个单位抗原配制例如：抗原效价的最高稀释倍数为28（1：256），则4个单位抗原为26，256÷4=1:64，即在63毫升的PBS液中加入1毫升抗原即可。
9血凝抑制试验1、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；2、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第10孔，最后从第10孔中吸取25ul弃掉；3、第1－11孔内加入4单位抗原25ul（第11孔为抗原对照第）4、振荡混匀，放于室温中静置30分钟或2-8°50分钟；5、1-12孔每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul（12孔为红细胞对照）；6、振荡，放于室温静置30分钟，或2-8℃45-60分钟；7、结果判定。以完全抑制的4个单位抗原的最高稀释倍数为该血清的HI效价。滴度≤23为阴性，≥24为阳性。8、见下图
10下图中的抗体效价依次为28、20、25、28
11抗体滴度：9、1、6、0、5、0、0；阳性对照：9
12下图中的抗体效价均为阴性，红细胞对照12孔成立（流淌），11孔抗原对照不流淌。
131%红细胞悬液的制备采集2-3只健康成年公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液与等体积的阿氏保护液（3.8%抗凝剂）混合，用PBS液（生理盐水代替）洗涤3次，吸掉血浆和白细胞膜，每次以3000转/分钟离心3-5分钟，洗至上清液由淡黄色变为透明色。最后用移液器或者刻度吸管吸取压积的红细胞泥，用PBS配制成1%的悬液，于4℃保存备用。（1份红细胞泥+9份生理盐水）
14阿氏保护液配制：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠0.8克，柠檬酸（枸橼酸）0.055克，氯化钠0.42克，加蒸馏水至100毫升，加热溶解后调PH值至6.1，然后高压灭菌15分钟，2-8°保存备用3.8%抗凝剂配制：枸橼酸钠3.8克，加入蒸馏水100毫升。PBS液：用临床用生理盐水代替。配方略。
15正确的操作校准的仪器优质的试剂标准、规范充分准备！！！检测质量控制措施注意
16注意事项1、四个单位抗原，红细胞悬液使用过程中要轻轻摇匀；2、移液器的吸头在反复洗吹时要插入液面以下但不可过深，避免使用中速度过快产生过多气泡造成移液量减少，每孔混匀完毕要将吸头内液体排尽。
17注意事项3、移液器使用时要用力均匀不可过力，吸头要安装牢固，防止使用过程中漏气或者掉落。吸头尽量使用一次性的，若反复使用要清洗干净，最好用超声波清洗机清洗，高压灭菌后使用，如果发现吸头堵住不能吸到液体或者弯曲及时淘汰。4、移液器在滴加液体，特别是在加抗原和红细胞悬液时一定不要深入液面中造成交叉污染，影响浓度造成结果较大误差，可以尝试悬空垂直加样。
18注意事项5、4个单位抗原配备一定要准确，如果配备的抗原效价高，那么抗体滴度就会低，反之抗体滴度会高，一般现用现配。回归试验来判定效价测定的正确与否。做法：做四排，每排的1-4孔加入生理盐水50UL，取配好的四个单位抗原50UL与第一孔做倍比稀释至最后一孔并弃掉50UL，最后每孔加入50UL红细胞悬液，震荡，静置20分钟观察结果。如果第一和第二孔完全凝集不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，则说明四个单位抗原配制正确。6、红细胞悬液在洗涤的过程中一定要把白细胞膜吸取干净，颜色为鲜红色，如果是暗红色很有可能发生了溶血。如果采集的红细胞免疫过禽流感，那么可以多洗涤几遍。红细胞悬液一般情况下可以存放3天，如果要保持一周左右就要在无菌情况下存放在阿氏保护液中。
19注意事项7、环境温度一定要重视，一般要求在室温下20-25°进行，如果低于15°反应结果就出现的慢；如果高于30°结果会出现的快；如果低于4°会发生红细胞自凝现在。因此，观察时间可以适当根据反应情况缩短，所以实验室要装有空调和温度计。8、微量反应版如果是有机玻璃的一定要清洗干净，孔底要透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不干净的反应板在试验中会出现自凝现象。使用正规厂家生产的一次性微量板就可杜绝这种情况。
20注意事项9、整板无红细胞凝集（流淌）现象，给人误认为抗体效价均为12。原因分析：1、4个单位抗原配制过低不足以凝集红细胞；2、环境温度过高；3、读数时间拖延；4、没有加4个单位抗原。10、整板红细胞凝集（不流淌）现象，原因分析：红细胞受污染或保存时间过长；4个单位抗原配制失败或滴加失误；生理盐水受到污染。11、跳孔：倍比稀释时顺序错乱；移液器吸取的量不准确。
21做好个人防护
