分支杆菌培养技术ppt课件

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1、分枝杆菌培养技术培养目的、意义、分类目的：分离培养临床标本中的分枝杆菌意义：诊断结核病金标准获得菌株鉴定试验纯培养物获得药敏试验所需的纯培养物疗效评估分类：简单法:酸性罗氏培养法离心集菌法：中性罗氏培养法、液体培养法（如MGIT960液体培养法）结核分枝杆菌生长要求专性需氧菌最适生长温度为37℃最适PH为6.5～7.2营养要求：氮源、碳源、无机盐（磷、铁、镁、钾、硫等）、生长因子结核分枝杆菌生长特点生长缓慢：在一般培养基上分裂一代需要18-24小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不

2、透明（液体培养基：絮状或颗粒状沉淀。）简单法操作步骤痰标本2-3ml1－2倍4%NaOH振荡匀化静置15分钟均匀接种0.1ml,2支斜面朝上，放置24小时37℃，培养8周简单法掌握要点1、原理2、标本类型3、仪器设备4、试剂耗材5、操作注意事项6、结果判读7、质量控制8、讨论一、原理分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长2%NaOH4%NaOH4%H2SO4注：不同浓度消化处理液对结核菌生长的影响二、标本类型痰、BF、体液（胸腹水、尿液、CSF等）、大便、组

3、织等注：标本是否留取合格不同标本类型的不同前处理过程保存方法三、仪器设备1、II级生物安全柜2、恒温培养箱3、漩涡振荡器4、冷冻离心机5、天平6、高压灭菌锅四、试剂耗材1、4%NaOH2、酸性罗氏培养基成分味精（谷氨酸钠）（纯度95%以上）7.2gKH2PO414g(中性2.4g)枸橼酸镁0.6gMgSO4·7H2O0.24g甘油（丙三醇）12ml蒸馏水600ml新鲜鸡卵液1000ml2%孔雀绿20ml85℃蒸气锅50分钟注：配制培养基需注意的问题、注意识别不合格培养基五、操作注意事项视痰标本性状，加l～2倍体积4％氢氧化钠(Na0H)消化液于痰瓶中，涡旋振荡器振荡2～3分

4、钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液后起，整个处理时间不得超过20分钟。样本数较多时，应分批处理。吸取经前处理后的痰液0.1毫升，无菌操作均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基。接种后，37℃平卧放置斜面24小时。然后，拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37℃继续培养。六、结果判读及报告分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。分枝杆菌培养阳性(1十)：菌落生长占斜面面积的1／4。分枝杆菌培养阳性(2十)：菌落生长占斜面面积的1／2。分枝杆菌培养阳性(3十)：菌落生长占斜面面积的3／4。分枝杆菌培养阳性(4十)：菌落生长布满全斜面。分枝杆菌培养阴

5、性应以“(培养阴性)”报告，不能以“(—)”表示。菌落生长不足以斜面面积1／4时，实报菌落数。（对可疑培养阳性标本，必须涂片进行抗酸染色确诊）六、结果判读及报告注：培养的第3天，之后每周记一次结果，对可疑的分支杆菌需涂片进行抗酸染色七、质量控制室内质量控制（QC）室间质量评估（EQA）现场评价(on-siteevaluation)：人力物力，难以日常监控盲法复检(blinded-rechecking)：痰标本用完难以重复批量测试(paneltesting)：在样本准备方面还需要更多的技术投入培养的质量保证目前主要依赖室内质量控制，辅以定期或不定期的现场评价。七、质量控制室内

6、质量控制人员培训、仪器设备监控、培养基无菌试验、生长试验每月对培养情况培养阳性率、涂阳培阳率和污染率的统计分析涂阳培阳率公式:培养阳性的病例总数———————————————×100%涂片检查阳性并进行培养的病例数初诊病人涂阳培阳率应大于90％污染率公式:污染的培养管数量———————————×100%培养管总数污染率应小于5%(2-5%)。可能原因解决方法未使用同一份标本做涂片培养使用与涂阳标本相同的标本进行培养标本运输时间过长，保存不当(时间、温度）标本留取后尽快培养（1周之内)，暂时无法培养应于4C冰箱保存。标本选择不当选择标本中脓样、干酪样可疑部分过处理（时间、浓度

7、)4％NaOH，1－2倍体积，15分钟接种量太小每管接种0.1毫升温箱温度不当温箱内置温度计，每日监测温度。涂阳培阳率过低？可能原因解决方法标本运输时间过长，保存不当(时间、温度）标本留取后尽快培养，暂时无法培养应于4C冰箱保存。前处理不充分4％，1－2倍，充分混旋，15分钟。材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。操作不当培训，预培养，严格按操作规程操作。培养基因素培养基质量控制污染率过高？总结简单法操作流程痰标本中加入1－2倍体积4％氢氧化钠涡旋振荡30-60秒室温静置15分钟接种：0.1ml，2管37C温箱培养水平