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乳与乳制品病原微生物检验方法粪链球菌群的检测YLNB4.81.仪器及器材1.1培养箱：36±1℃1.2冰箱：0~4℃1.3恒温水浴：46±1℃1.4天平1.5电炉1.6吸管1.7广口瓶或三角瓶：容量为500ml1.8玻璃珠：直径5mm1.9平皿：直径约90mm1.10试管1.11放大镜1.12菌落计数器1.13酒精灯1.14均质器或乳钵1.15试管架1.16灭菌刀或剪子1.17灭菌镊子2.培养基和试剂
12.1：pfrzir肠球菌选择性培养基（PSE）：按SN/T0475-95中规定或按购买的商用培养基配方配制。2.2：KF链球菌琼脂：按SN/T0475-95中规定或按购买的商用培养基配方配制。2.3：叠氮化钠葡萄糖肉汤：按SN/T0475-95中规定或按购买的商用培养基配方配制。2.4：生理盐水2.5：75%乙醇溶液3.检验程序方法一：平板计数法：粪链球菌的检验程序如下：检样做成几个适当倍数的稀释液选择2-3个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿中每个皿内加入适量KF琼脂(或PSE琼脂)36±1℃48±
22h(或24±2h)菌落计数报告3.1操作步骤3.1.1检样稀释及培养3.1.1.1以无菌操作将检样25g（或ml）剪碎放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。3.1.1.2用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。3.1.1.3另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。3.1.1.4
3根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内。3.1.1.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的pfrzir肠球菌选择性培养基或kf链球菌培养基（可放置于46±1℃水浴中保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内做空白对照。3.1.1.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃培养箱内培养48±2h（24±12h）。3.1.2菌落计数方法做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。粪链球菌在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐，琼脂表面下菌落呈椭圆或晶体状；在PSE平板上形成带棕色环的棕黑色菌落。选择有30-300个菌落的平板进行计数（菌落计数的报告按照GB/T4789.2的相关条例），按粪链球菌数/g(mL)报告结果。方法二：多管法：4.1检验程序：
4检样稀释叠氮化钠葡萄糖肉汤管36±1℃，24±2h
5混浊混浊不明显不混浊继续培养至48±2hPSE平板36±1℃，24±2h粪链球菌阴性报告是否带棕色环的棕黑色菌落
6否是粪链球菌阳性粪链球菌阴性报告4.2方法4.2.1检样稀释（同方法一）4.2.2接种培养：选适当稀释液的样液接种一套叠氮化钠肉汤管，接种量在1ml或1ml以下者
7用10ml单料管，接种量为10ml者用10ml双料管。每一稀释度接种3管，置36±1℃培养箱内，培养24±2h，检查各试管的混浊情况，如果所有试管不混浊，则可报告为粪链球菌阴性，如果有混浊情况，按下列程序进行。（若混浊不明显继续培养至48±2h后记录结果。）4.2.3确证试验：培养24±2h或48±2h之后，对所有产生混浊的试管进行确证试验，用接种环将各管的培养物划线于PSE平板上，36±1℃培养24±2h，在平板上出现的带棕色环的棕黑色菌落，确证为粪链球菌群细菌。4.2.4报告根据证实为粪链球菌阳性的管数查MPN检索表,报告每1ml（g）粪链球菌群的最可能数。MPN检索表见附录。附录：1g样品中最可能数（MPN）表阳性管数阳性管数0.1ml0.01ml0.001mlMPN0.1ml0.01ml0.001mlMPN000≤303113002603216002603319
800391003.601031017.20116.1102110129.211215013121107.30206.2111110219.311215022121131902316120111222012115123242313613016232441312023353132243002313329301392009.13026420114303952022031043203263117521015312120211203131602122732093
92133432115022021322210221283232902223533024022342331460230293321100333﹥1100注：表内所列样品量如改为1，0.1，0.01g(ml)时，表内数字应相应降低10倍；如改为0.01，0.001，0.0001g(ml)时，则表内数字相应增加10倍，其余可类推。回首页附图1金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。 革兰氏染色阳性。
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11附图2金黄色葡萄球菌的平板菌落照片 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。 平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。
12回首页附图3金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态 金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润,直径2～3mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。
13回首页 附图4志贺氏菌落在SS平板上的照片
14大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌
15是沙门氏菌。有黑色中心。
16如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。回首页附图5大肠杆菌革兰氏染色照片
