细菌内毒素验证

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细菌内毒素方法验证1

1细菌内毒素验证基本程序试验准备确定样品内毒素限值选择试剂计算MVD鲎试剂灵敏度复核试验供试品干扰初筛试验干扰试验结果判断计算公式：MVD=cL/λMVD为供试品的最大有效稀释倍数，c为供试品溶液的浓度，L供试品的细菌内毒素限值。如果计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式MVc=λ/L.2

2鲎试剂灵敏度复核试验根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品加入1ml内毒素检查用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后按所用的鲎试剂灵敏度2λ、λ、0.5λ、0.25λ进行稀释。0.1ml鲎试剂+0.1ml标准品，平行4管；NC：0.1ml鲎试剂+0.1mlBET用水，平行2管37℃±1℃孵育60min±2min。结果判断：反应管缓缓倒转180°，阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落；阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。实验有效：NC管全部阴性（--），2.0λ管全部阳性（++++），0.25λ管全部阴性（----）。数据处理：灵敏度测定值λc=antilg(ΣX/n)。X：为反映终点浓度的对数值（lg),反映终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。3

3干扰试验预试验先用少量的鲎试剂初步确定供试品的最大不干扰浓度，为正式干扰试验提供依据。例：某样品C：100单位/mlL：0.8EU/单位λ：0.25EU/mlMVD0.25=320倍MVC0.25=λ/L=0.3125单位/mlMVC0.125=λ/L=0.156单位/mlMVC0.06=λ/L=0.078单位/mlMVC0.03=λ/L=0.039单位/ml100单位/ml→20单位/ml→10单位/ml→5单位/ml→2.5单位/ml→1.25单位/ml→0.625单位/ml→0.3125单位/ml→0.156ml/ml→0.078单位/ml→0.039单位/ml分别用4λ的内毒素标准品与各梯度的供试品等量稀释，得到相应的供试品阳性对照。4

4干扰试验预试验结果一供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验结果二供试品在某浓度开始无干扰，可选择该浓度或者跟低浓度进行干扰试验供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水供试品溶液----------供试品阳性对照++++++++++MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水供试品溶液----------供试品阳性对照--++++++++5

5干扰试验预试验结果三假阳性，更换另一批供试品进行测试结果四假阴性，消除干扰后再测试供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水供试品溶液++++++++--供试品阳性对照++++++++++供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水供试品溶液----------供试品阳性对照--------++6

6正式干扰试验根据最大不干扰浓度选用相应灵敏度的鲎试剂作正式干扰试验。编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管A无/供试品溶液———2B2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ2222D无/检查用水———27

7正式干扰试验上张表中，A为供试品溶液，B为干扰试验系列；C为鲎试剂表示灵敏度的对照系列；D为阴性对照只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。干扰试验中我们需要对三批供试品，两个不同厂家的鲎试剂进行试验8

8干扰试验结果举例2λ（2λ）1λ（1λ）0.5λ（0.5λ）0.25λ（0.25λ）阴性对照++++-----++++-----++--++--例1、批号1——厂家1鲎试剂试验结果2、批号1——厂家2鲎试剂试验结果3、重复做3批，计算结果2λ（2λ）1λ（1λ）0.5λ（0.5λ）0.25λ（0.25λ）阴性对照++++-----++++-----+---+---9

9正式干扰试验接受标准当阴性对照4管为阴性，两组最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性时，试验结果有效。Et/Es值在0.5～2（包括0.5、2）之间为无干扰，反之为有干扰正式干扰试验结果计算：用内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液制成的内毒素的反应终点浓度的几何平均值（Et）。Es=antilg(∑Xs/4)Et=antilg(∑Xt/4)Xs，Xt分别为系列溶液反应终点浓度的对数值（lg）。10

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